聶志紅 李波靜

(上海浦東新區(qū)公利醫(yī)院消化科，上海 200135)

近年來，消化性潰瘍合并糖尿病的病例逐年增多。與不合并糖尿病的消化性潰瘍患者相比，消化性潰瘍合并糖尿病患者的潰瘍愈合時間較長，復發(fā)率較高，出血風險較大，易進展為難治性潰瘍[1-2]。本研究分析了消化性潰瘍合并2型糖尿病患者的外周血內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)的數(shù)量和功能的變化，以期為消化性潰瘍合并2型糖尿病的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2011年1月—2013年12月收治的消化性潰瘍合并2型糖尿病患者32例(A組)、消化性潰瘍不合并2型糖尿病患者32例(B組)。A組男性18例，女性14例；年齡55～79歲，平均(64.4±6.3)歲。B組男性17例，女性15例；年齡56～79歲，平均(65.1±5.8)歲。兩組均除外腫瘤、外周血管病變及消化道出血患者。另選取同期健康志愿者32例作為對照組(C組)，其中男性18例，女性14例；年齡54～78歲，平均(64.8±6.9)歲。3組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組一般資料比較

1.2 診斷標準 消化性潰瘍的診斷依據(jù)2008年中華醫(yī)學會消化病學會制定的《消化性潰瘍病診斷與治療規(guī)范》[3]，且經(jīng)胃鏡以及病理明確診斷；2型糖尿病的診斷采用2007年中華醫(yī)學會糖尿病學會制定的《中國2型糖尿病防治指南》[4]。

1.3 測定方法

1.3.1 EPC的定量分析

1.3.1.1 EPC抗體標記 取5.0 mL EDTA鈉抗凝外周血，溶解紅細胞，加入抗人CD34-PE、CD133-PE-CY5、KDR-APC直標抗體(德國美天生物技術(shù)公司)，4℃孵育標記40 min，1000 r/min離心5 min，PBS洗2遍，加入PBS 300 μL。將標記好的細胞轉(zhuǎn)入已含106個熒光微球的測試管(德國美天生物技術(shù)公司)，待用。

1.3.1.2 流式分析 開機，預(yù)熱15 min。進入細胞獲取界面。設(shè)門，調(diào)節(jié)參數(shù)角散射光(FSC)、側(cè)向散射光(SSC)、熒光強度探測器1、2、3和4(FL1、FL2、FL3和FL4)等參數(shù)，分析2.0×105萬個細胞(含熒光微球)，然后用cell quest分析軟件分析，獲得EPC和熒光微球的比例，再根據(jù)熒光微球的已知數(shù)量，獲得每毫升外周血EPC的絕對數(shù)量[5]。

1.3.2 EPC染色 從3組外周血中分離獲取單個核細胞并體外培養(yǎng)7 d后，用臺酚藍染色，觀察細胞形態(tài)。

1.3.3 EPC的功能測定 (1)黏附能力：取5 mL肝素抗凝的外周血，溶解紅細胞，加入EPC特異性抗體，用胰蛋白酶消化細胞并收集細胞，加入含胎牛血清的EBM-2[endothelial cell growth medium-2，內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2；含20%胎牛血清、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)50 ng/mL、干細胞因子(stem cell factor，SCF) 50 ng/mL，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL]，計數(shù)之后以5×105個/mL接種在人纖維連接蛋白包被的24孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)30 min后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗未貼壁的細胞后計數(shù)貼壁細胞的數(shù)量[6]；(2)增殖能力：用(1)中同樣方法收集貼壁細胞，以1×105個/mL將EPC接種在人纖維蛋白包被的96孔培養(yǎng)板中，再于每孔中加入10.0 mL MTT(二苯基四氮唑嗅鹽，5 g/L)，培養(yǎng)4 h，去除上層清液，加入二甲基亞砜，振蕩10 min，用酶標儀檢測各孔吸光度(波長490 nm)；(3)遷移能力：收集貼壁細胞，用EBM-2培養(yǎng)基懸浮細胞并計數(shù)。將含血管內(nèi)皮生長因子(VEGF，10 μg/L,英國Peprotee公司)的25.0 mL EBM-2培養(yǎng)液加入改良的Boyden小室下室，然后將含2.0×104個EPC的50.0 mL懸浮液加入上室，培養(yǎng)24 h，刮去濾膜上未移動的細胞后，甲醛固定并用Giemsa染色，于顯微鏡下隨機選取3個視野進行觀察，計算遷移到下室底層的細胞的數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡下觀察EPC 外周血中分離獲取單個核細胞，體外培養(yǎng)7 d后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細胞呈小桿型與梭型，貼壁，并且細胞連接成條索狀的結(jié)構(gòu)(圖1)。

2.2 3組外周血中EPC的含量比較 A組外周血中含(39.68±7.58)個/mL EPC，B組為(44.47±11.50)個/mL，C組為(58.42±14.85)個/mL。A、B組EPC的含量均低于C組，A組EPC含量低于B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 3組EPC的功能比較 A組和B組EPC的黏附、增殖、遷移能力均明顯低于C組，A組EPC的黏附、增殖、遷移能力明顯低于B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組EPC的黏附、增殖、遷移能力的比較

3 討 論

消化性潰瘍的形成、愈合、復發(fā)與消化道黏膜的血液循環(huán)狀態(tài)密切相關(guān)。2型糖尿病患者因糖脂代謝的紊亂常發(fā)生消化道黏膜血液循環(huán)障礙，消化道毛細血管及毛細血管前小動脈基底膜增厚、血管內(nèi)皮細胞增生、再生能力下降，消化道黏膜屏障的保護作用減弱，進而導致消化性潰瘍的發(fā)生[7-8]。研究[9]表明，糖尿病患者因微循環(huán)較差，組織細胞再生能力減弱，故消化性潰瘍愈合時間長、愈合質(zhì)量下降。

目前大量研究已經(jīng)證實EPC是一種多功能干細胞，在特定的條件下能夠分化為成熟血管內(nèi)皮細胞。EPC通常存在于骨髓中，并處于休眠狀態(tài)，當組織缺血或血管損傷時，被動員到外周血中，進一步分化、增殖、遷移，促進內(nèi)皮損傷部位的修復和微血管的生成。研究[10-13]發(fā)現(xiàn)，外周血EPC與糖尿病的微血管病變有著密切關(guān)系，但外周血EPC是否與合并糖尿病的消化性潰瘍有關(guān)，目前尚未見報道。本研究中分離并培養(yǎng)的EPC細胞鏡下呈小桿型與梭型，貼壁，細胞連接成條索狀的結(jié)構(gòu)；A組和B組EPC的數(shù)量及功能均低于C組；A組EPC數(shù)量及功能低于B組；這說明消化性潰瘍無論是否合并2型糖尿病，外周血中EPC數(shù)量及功能均降低，但合并糖尿病患者EPC的數(shù)量及功能下降更顯著，提示合并2型糖尿病的消化性潰瘍的發(fā)生、發(fā)展與EPC的分化、增殖、遷移相關(guān)。近來研究[13]還發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖聯(lián)合EPC可以刺激血管生成，用于治療糖尿病雄鼠肢端缺血，取得較為理想效果，亦為今后糖尿病合并消化道潰瘍的治療提供了新的思路。

[1]王實,趙秋楓.糖尿病患者胃潰瘍的臨床愈合率[J].胃腸病學,2007,12(4):240-241.

[2]Peng YL, Leu HB, Luo JC, et al. Diabetes is an independent risk factor for peptic ulcer bleeding: A nationwide population-based cohort study[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2013, 28(8): 1295-1299.

[3]中華消化雜志編委會，消化性潰瘍病診斷與治療規(guī)范建議(2008，黃山)[J].中華消化雜志, 2008,28(7):447-450.

[4]中華醫(yī)學會糖尿病學分會. 中國2型糖尿病防治指南(2007) [J]. 中華醫(yī)學雜志,2008,88：1227-1245.

[5]Zhou Y, Zhu J, Zou L, et al. Changes in number and biological function of endothelial progenitor cells in hypertension disorder complicating pregnancy[J]. Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2008, 28(6):670-673.

[6]Yin M, Yuan Y, Liu C, et al.Combinatorial coating of adhesive polypeptide and anti-CD34 antibody for improved endothelialcell adhesion and proliferation[J]. Mater Sci Mater Med, 2009,20(7):1513-1523.

[7]Murata A, Matsuda S, Kuwabara K, et al.The influence of diabetes mellitus on short-term outcomes of patients with bleeding peptic ulcers[J]. Yonsei Med, 2012, 53(4):701-707.

[8]Peng YL, Leu HB, Luo JC, et al. Diabetes is an independent risk factor for peptic ulcer bleeding: a nationwide population-based cohort study.[J] Gastroenterol Hepatol, 2013, 28(8):1295-1299.

[9]Harsch IA, Brzozowski T, Bazela K, et al. Impaired gastric ulcer healing in diabetic rats: role of heat shock protein, growth factors, prostaglandins and proinflammatory cytokines[J]. Eur J Pharmacol, 2003, 481 (2-3): 249-260.

[10]Lois N, McCarter RV, O'Neill C, et al. Endothelial progenitor cells in diabetic retinopathy[J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2014, 9(5): 44.

[11]Kotlinowski J, Dulak J, Józkowicz A. Type 2 diabetes mellitus impairs endothelial progenitor cells functions[J]. Postepy Biochem, 2013, 59(3): 257-266.

[12]Zhang W, Yan H. Dysfunction of circulating endothelial progenitor cells in type 1 diabetic rats with diabetic retinopathy[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2013, 251(4): 1123-1131.

[13]Tu S, Shao A, Ren L, et al. Angiogenesis effect of Astragalus polysaccharide combined with endothelial progenitor cells therapy in diabetic male rat following experimental hind limb ischemia[J]. Chin Med J (Engl), 2014, 127(11): 2121-2128.