凌躍新 童賽雄

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，上海 200032)

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種多肽生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞等多種細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和形態(tài)改變的作用。HGF主要在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，但在小腸、大腦、甲狀腺、胸腺和胎盤中也有表達(dá)[1]。近年發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤組織中均可檢測(cè)到HGF的過(guò)度表達(dá)，說(shuō)明HGF可能在腫瘤進(jìn)展中有重要作用。本研究旨在探討HGF對(duì)人胃癌細(xì)胞株AGS增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人胃癌細(xì)胞株AGS購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化工公司，人HGF試劑盒購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Corning公司，RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，BioRAD酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清， 100 U/mL青霉素， 100 μg/mL鏈霉素，0.056%NaHCO3，pH值7.4)，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)AGS細(xì)胞，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后將細(xì)胞加入96孔板，5000個(gè)/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別用濃度為0、25、50、75和100 ng/mL的HGF處理，終體積200 μL。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h后，每孔加入10 μL 0.1 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在450 nm處的光密度D值。

2 結(jié) 果

采用終濃度分別為25、50、75和100 ng/mL的HGF處理AGS細(xì)胞，并在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行增殖試驗(yàn)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的HGF對(duì)AGS細(xì)胞均有促增殖作用，且隨HGF濃度增加或作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖活力呈上升趨勢(shì),在72 h最為明顯。各濃度組HGF與陰性對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.89、5.28、9.73和11.00，P<0.01)。不同實(shí)驗(yàn)組在同一時(shí)間段進(jìn)行比較，在細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)，各HGF濃度下的細(xì)胞增殖活力均顯著高于24 h組(P<0.01)；在細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)，HGF濃度為25、50、75 ng/mL的組別的細(xì)胞增殖活力均極顯著高于24 h組(P<0.01)，僅HGF為 100 ng/mL的組別細(xì)胞增殖活力顯著高于24 h組(P<0.05)。這表明在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，HGF對(duì)人胃癌細(xì)胞株AGS增殖的影響存在濃度依賴關(guān)系和時(shí)間依賴關(guān)系。見圖1。

與24 h組比較，**P<0.01, *P<0.05

3 討 論

HGF在80年代被發(fā)現(xiàn)，因其對(duì)肝細(xì)胞具有較強(qiáng)的絲裂原作用而被命名為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子[2]。Stoker等[3]發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞能分泌一種促進(jìn)上皮細(xì)胞集落擴(kuò)散的細(xì)胞因子，稱為離散因子(scatter factor,SF)。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，HGF和SF為同一物質(zhì)。HGF受體是原癌基因c-Met編碼的跨膜蛋白產(chǎn)物，具有酪氨酸激酶活性。HGF基因編碼含有728個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。成熟的HGF的相對(duì)分子量在非還原狀態(tài)下為90 kD，是由60 kD的α鏈和30 kD的β鏈經(jīng)二硫鍵連接而成的異二聚體，由前體蛋白分解斷裂產(chǎn)生。HGF的α鏈?zhǔn)且粋€(gè)可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的N末端區(qū)，連接4個(gè)絞鏈區(qū)域，α鏈N末端的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)、前2個(gè)絞鏈區(qū)結(jié)構(gòu)和α鏈存在是HGF發(fā)揮生物學(xué)活性的必要條件。HGF的α鏈可以單獨(dú)與c-Met結(jié)合，但缺乏α鏈的HGF將喪失其生物學(xué)活性[4]。

HGF主要由腫瘤組織中的成纖維細(xì)胞分泌，亦可由腫瘤細(xì)胞分泌。有些腫瘤細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)HGF和c-Met，腫瘤組織產(chǎn)生的HGF可通過(guò)自分泌和旁分泌途徑來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與腫瘤組織中HGF含量有關(guān)，血清 HGF值隨著腫瘤的進(jìn)展而升高。HGF的過(guò)度表達(dá)常提示腫瘤的惡性程度高，且易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[5]。HGF與腫瘤細(xì)胞上的c-Met結(jié)合后，可刺激細(xì)胞增殖，并參與腫瘤新生血管的生成。

本研究結(jié)果顯示，在25～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)，HGF可促進(jìn)AGS細(xì)胞的增殖，隨著HGF濃度的增加或作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng)，呈時(shí)間、濃度依賴關(guān)系(P<0.01)，提示HGF對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。Lee等[6]研究發(fā)現(xiàn)，用HGF刺激人胃癌細(xì)胞后，可上調(diào)細(xì)胞中Jun B和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)，使癌細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖和侵襲能力。Recio等[7]對(duì)鼠黑色素瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，HGF通過(guò)增加cyclin D1蛋白的表達(dá)，可激活細(xì)胞內(nèi)p38-ATF-2信號(hào)通路，最終影響細(xì)胞增殖。Zhang等[8]用HGF處理人平滑肌肉瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，HGF通過(guò)激活c-Src激酶而激活細(xì)胞內(nèi)Stat3信號(hào)通路，以此促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述， HGF在體外對(duì)人胃癌細(xì)胞株AGS的增殖有促進(jìn)作用，且呈時(shí)間、濃度依賴性。

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