湯羅嘉 姚晨玲 張晨

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院急診科，上海 200032)

敵敵畏屬于有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥，主要用作殺蟲劑。急性有機(jī)磷中毒(acute organophosphorus pesticides poisoning，AOPP)是臨床常見的危重急癥。近年來，呼吸機(jī)[1]、血液凈化[2]等技術(shù)的應(yīng)用提高了AOPP的搶救成功率，但對于AOPP所致橫紋肌損傷方面的研究甚少。研究[3]發(fā)現(xiàn)，Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與了AOPP的病理損傷過程，本研究探討了ROCK抑制劑(法舒地爾)對AOPP大鼠心肌與骨骼肌的保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級雄性Sprague Dawley大鼠24只，8周齡，體質(zhì)量210～230 g，由復(fù)旦大學(xué)附屬上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號 SCXK滬2009-0019)，在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要儀器與試劑 敵敵畏原液(上海允發(fā)化工有限公司)，加注射用水配置成1 g/L溶液；法舒地爾注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司)；大鼠肌酸激酶同工酶MM(creatine kinase isoenzyme MM，CK-MM)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒、大鼠乳酸脫氫酶同工酶M(lactate dehydrogenase isoenzyme M，LDH-M)ELISA檢測試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)；自動(dòng)生化分析儀(VITROS950，美國瓊森公司)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)儀(7500 Fast，美國ABI公司)；DW-2000動(dòng)物人工呼吸機(jī)(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將24只大鼠隨機(jī)分為對照組、中毒組、干預(yù)組，每組8只。大鼠手術(shù)前晚禁食不禁水，稱體質(zhì)量后，經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉。將大鼠固定于仰臥位，分離頸部組織作氣管插管，連接DW-2000動(dòng)物人工呼吸機(jī)，作人工呼吸(60次/min)。對照組經(jīng)腹腔注射0.9%氯化鈉液0.4 mL，中毒組和干預(yù)組均經(jīng)腹腔注射敵敵畏30 mg/kg(LD50)。干預(yù)組在麻醉前30 min經(jīng)腹腔注射法舒地爾10 mg/kg。腹腔注射后2 h采集血樣，在該時(shí)間點(diǎn)之前死亡的大鼠排除在本研究之外。

1.4 血清標(biāo)本測定 腹腔注射后2 h，經(jīng)頸動(dòng)脈置管放血，血標(biāo)本靜置15 min，以5000 r/min離心3 min，取上清液，-80 ℃冰箱保存。應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀檢測血清心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)水平；采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清CK-MM、LDH-M水平。

1.5 橫紋肌ROCKI mRNA表達(dá)的檢測 采血后，各取大鼠左側(cè)腓腸肌及左心室心肌組織50 mg，加入1 mL Trizol液，充分勻漿。采用RT-PCR法分別檢測左側(cè)腓腸肌及左心室心肌ROCKI mRNA的表達(dá)。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

SYBR Green 10 μL，上游引物(5 μmol/L)1 μL，下游引物(5 μmol/L)1 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，加水至20 μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為：95℃，10 s；95℃，5 s；60℃，2 s；共40個(gè)循環(huán)。

表1 ROCKI和β-actin基因的引物序列及片斷長度

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 對照組大鼠無異常表現(xiàn)。中毒組、干預(yù)組大鼠在腹腔注射敵敵畏后均出現(xiàn)呼吸道分泌物增多、肌肉痙攣與顫動(dòng)、兩便失禁等AOPP癥狀。所有癥狀在中毒后5～7 min出現(xiàn)并達(dá)到發(fā)作高峰，持續(xù)30～60 min。干預(yù)組的癥狀相對較輕，分泌物較少，肌肉顫動(dòng)幅度與頻率小。

2.2 血清學(xué)結(jié)果 與對照組比較，中毒組與干預(yù)組大鼠血清cTnT值均升高(P<0.05)，而干預(yù)組的升高幅度明顯小于中毒組(P<0.05)。對照組、中毒組與干預(yù)組大鼠血清CK-MM、LDH-M值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 大鼠血清cTnT值及CK-MM、LDH-M值的變化比較

2.3 橫紋肌RT-PCR檢測結(jié)果 (1)左心室心肌ROCKI mRNA值：與對照組比較，中毒組表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與中毒組比較，干預(yù)組表達(dá)受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)左側(cè)腓腸肌ROCKI mRNA值：與對照組比較，中毒組表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與中毒組比較，干預(yù)組表達(dá)受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3橫紋肌ROCKImRNA的相對表達(dá)值

注：與對照組比較，aP<0.05；與中毒組比較，bP<0.05

3 討 論

應(yīng)用抗膽堿藥與膽堿能復(fù)活藥治療AOPP，可以對抗毒蕈堿樣(M樣)癥狀與部分煙堿樣(N樣)癥狀。重癥AOPP患者常伴有心力衰竭、骨骼肌痙攣、強(qiáng)直、呼吸衰竭。對此類患者，在加大解毒劑治療劑量的同時(shí)，也增加了藥物的不良反應(yīng)，如阿托品中毒及呼吸抑制等。

國外學(xué)者[3]在大鼠急性敵敵畏中毒實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Rho抑制劑Y-27632預(yù)處理后，大鼠死亡率明顯下降。提示Rho/ROCK信號通路可能參與了AOPP中毒的機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，AOPP時(shí)，應(yīng)用法舒地爾干預(yù)后，大鼠左心室心肌及左側(cè)腓腸肌ROCKI mRNA表達(dá)受到抑制，橫紋肌的中毒癥狀減輕，中毒指標(biāo)好轉(zhuǎn)；與中毒組比較，干預(yù)組血清cTnT值升高幅度明顯降低，表明法舒地爾對AOPP大鼠橫紋肌有保護(hù)作用，此保護(hù)作用與下調(diào)ROCKI mRNA表達(dá)、抑制Rho/ROCK通路密切相關(guān)。

法舒地爾是一種ROCK抑制劑。ROCK被認(rèn)為是各種信號途徑特別是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白收縮信號的整合點(diǎn)。ROCKI是在心肌、肺和骨骼肌分布為主的亞型，參與了許多重要生物學(xué)行為的調(diào)控，細(xì)胞的增生和分化、運(yùn)行和移行、生存和死亡[4-5]都與其相關(guān)。

ROCKI作用的經(jīng)典底物主要包括：肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)、肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)。Rho/ROCK途徑可通過直接作用于MLC或間接作用于肌球蛋白磷酸酶靶蛋白1(MYPT1)來增加胞漿內(nèi)MLC的磷酸化程度，維持細(xì)胞收縮[6]。在AOPP時(shí)，心肌與骨骼肌的Rho/ROCK信號通路被激活，肌肉興奮性提高。法舒地爾通過抑制ROCK的過度表達(dá)，一定程度上減輕了橫紋肌的中毒癥狀，起到了保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，雖然應(yīng)用法舒地爾可以使AOPP大鼠骨骼肌痙攣的癥狀得到緩解，但是相關(guān)肌酶中只有心肌酶CTnT的表達(dá)顯著下降，而CK-MM與LDH-M在中毒組與干預(yù)組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原因可能與測定指標(biāo)的敏感性與時(shí)效性相關(guān)。

[1]蔡志芳,王雪峰,姚漢玲,等.重度有機(jī)磷中毒患者早期應(yīng)用機(jī)械通氣的臨床效果觀察[J].臨床肺科雜志,2013,18(11):2116-2117.

[2]Yu HJ,Shen DF,Liu B,et al.The observations of curative efficacy of rhubarb combined with blood purification on treatment patients with severe acute organophosphorus pesticide poisoning[J].Chinese journal of industrial hygiene and occupational diseases,2012,30(4):304-306.

[3]Gunay N,Kose B,Demiryurek S,et al.Effects of a selective Rho-kinase inhibitor Y-27632 on oxidative stress parameters in acute dichlorvos poisoning in rats[J].Cell Biochem Funct,2008,26(7):747-754.

[4]Di Cristofano A,Pandolfi PP.The multiple roles of PTEN in tumor suppression[J].Cell,2000,100(4):387-390.

[5]Hall A.Rho GTPases and the actin cytoskeleton[J].Science,1998,279(5350):509-514.

[6]Deaton RA,Su C,Valencia TG,et al.Transforming growth factor-beta1-induced expression of smooth muscle marker genes involves activation of PKN and p38 MAPK[J].J Biol Chem,2005,280(35):31172-31181.