陳保星，許 冰，朱丙帥

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽胰外科 河南 鄭州 450052）

聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜在門脈高壓大鼠賁門周圍血管離斷術(shù)中的應(yīng)用

陳保星，許 冰，朱丙帥

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽胰外科 河南 鄭州 450052）

目的：評(píng)價(jià)聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜在門脈高壓大鼠賁門周圍血管離斷術(shù)中防止粘連再生及減少新生血管的效果。方法：將40只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。兩組均以部分門靜脈結(jié)扎法建立肝前型門靜脈高壓癥大鼠模型，對(duì)照組僅行賁門周圍血管離斷術(shù)，實(shí)驗(yàn)組行賁門周圍血管離斷術(shù)并用聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜包繞賁門周圍創(chuàng)面。術(shù)后第4周處死大鼠，觀察賁門周圍組織粘連情況，進(jìn)行宏觀分級(jí)，切取賁門及其周圍粘連組織，將標(biāo)本蠟塊包埋后免疫組織化學(xué)染色觀察白細(xì)胞分化抗原34（cluster of differentiation 34，CD34）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)情況，觀察分析賁門周圍組織粘連程度及新生血管生成情況。結(jié)果：腹腔臟器粘連宏觀分級(jí)中，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組粘連臟器相對(duì)較少，粘連分級(jí)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)顯示，實(shí)驗(yàn)組在粘連程度及新生血管生成情況上均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜在一定程度上可以預(yù)防、減少門脈高壓大鼠賁門周圍血管離斷術(shù)后粘連形成以及新生血管生成。

聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜；賁門周圍血管離斷術(shù)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；白細(xì)胞分化抗原34

賁門周圍血管離斷術(shù)可用于門靜脈高壓癥的手術(shù)治療［1］，它是通過阻斷門靜脈系統(tǒng)與奇靜脈之間的側(cè)支循環(huán)，以達(dá)到控制門靜脈高壓癥引起的食管胃底靜脈曲張破裂出血的目的，但術(shù)后仍有一定的再出血率，楊鎮(zhèn)、陳立波等［2-3］報(bào)道單純斷流術(shù)組5年再出血率為3.3％～6.9％，10年再出血率為8.0％～13.3％。其中再出血原因可能包括：手術(shù)操作不規(guī)范、斷流不徹底；術(shù)后門靜脈高壓引起賁門周圍新生血管形成，致側(cè)支循環(huán)再建復(fù)發(fā)出血等。聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜是一種特殊的可吸收材料，能夠有效的保護(hù)軟組織，防止術(shù)后軟組織粘連，減少術(shù)后創(chuàng)面粘連再生及新生血管形成。本實(shí)驗(yàn)擬通過門靜脈主干部分結(jié)扎法復(fù)制大鼠肝前性門靜脈高壓癥模型［4］，然后對(duì)該模型大鼠行賁門周圍血管離斷術(shù)，其中實(shí)驗(yàn)組行賁門周圍血管離斷術(shù)后應(yīng)用聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜包繞賁門創(chuàng)面，對(duì)照組單純行賁門周圍血管離斷術(shù)，觀察大鼠賁門周圍組織的粘連情況，評(píng)估聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜阻止賁門周圍粘連形成及新生血管生成的效果，探討其對(duì)治療和再出血提供的線索。

1 材料和方法

1.1 材料 SD雄性大白鼠由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜購(gòu)自MAST Blosurgery Inc公司；VEGF（鼠抗人單克隆抗體）、CD34（鼠抗人單克隆抗體）購(gòu)自Santa Cruz生物技術(shù)公司；SP試劑盒、DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉生物工程公司。

1.2 手術(shù)方法 將40只SD雄性大白鼠（180～200 g）隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各20只。飼養(yǎng)條件：于有通氣裝置的飼養(yǎng)箱中，溫度20～25℃，濕度40％～60％，12 h光暗周期。手術(shù)前1周讓大鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)。術(shù)前1 d晚上禁食12 h，手術(shù)當(dāng)天禁食水。

以10％水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下作劍突下正中切口2.0～3.0 cm，進(jìn)腹前生理鹽水沖洗無(wú)菌橡膠手套。游離門靜脈近肝端，在門靜脈外緣平行放置1個(gè)外徑為0.8 mm（21 G）的鈍性針頭，用3-0絲線結(jié)扎門靜脈主干及與之靠近的鈍性針頭（結(jié)扎點(diǎn)盡量靠近門靜脈左右分支處），拔出針頭后即可形成門靜脈部分結(jié)扎。實(shí)驗(yàn)組以無(wú)損傷鉗徹底游離食管中下段及賁門后，剪取一1.5 cm×1.5 cm聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜包繞賁門周圍（見圖1）。對(duì)照組僅游離食管中下段及賁門。術(shù)后4周處死大鼠，切取賁門及其周圍粘連組織，生理鹽水洗凈后固定于4％甲醛液中，石蠟包埋、切片，進(jìn)行VEGF、CD34免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)［5-6］。

圖1 聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜放置前后比較

1.3 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 宏觀分級(jí)：參考The Diamond Classification［7］，對(duì)賁門周圍粘連范圍、粘連組織韌性分級(jí)。粘連范圍：0級(jí)賁門周圍無(wú)粘連，1級(jí)賁門周圍少許膜性粘連，2級(jí)肝左外葉、肝尾葉、賁門周圍粘連，3級(jí)與膈肌間粘連條帶形成，4級(jí)大網(wǎng)膜、小腸粘連。

1.3.2 免疫組化分析：①VEGF結(jié)果評(píng)定：VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位在胞漿或胞膜上，呈棕黃色或黃色的顆粒狀物質(zhì)。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞漿被染為棕黃（褐）色為陽(yáng)性，反之則為陰性。采用形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組免疫組化切片隨機(jī)采集、放大，輸入計(jì)算機(jī)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），測(cè)定平均積分光密度值顯示相對(duì)含量。②微血管密度（MVD）的判定方法CD34陽(yáng)性表達(dá)主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜或胞漿中，呈現(xiàn)棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇團(tuán)，其代表微血管密度（microvessel density，MVD）。按Weidner等［8］報(bào)道的計(jì)數(shù)方法，首先在低倍鏡（×100）下掃視整個(gè)切片，以染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)，尋找3個(gè)血管密度最高的區(qū)域（即所謂“熱點(diǎn)”），然后在200倍視野范圍分別計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的微血管數(shù)，取其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、相關(guān)性分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹腔臟器粘連宏觀表現(xiàn) 對(duì)照組粘連范圍所涉及臟器多為肝左外葉、肝尾葉、食管、胃底，少數(shù)存在大網(wǎng)膜、小腸粘連；實(shí)驗(yàn)組所涉及的粘連臟器多為肝左外葉、胃底，無(wú)大網(wǎng)膜及小腸粘連（見圖2）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組在粘連分級(jí)中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

圖2 兩組大鼠腹腔臟器粘連情況比較

表1 大鼠腹腔臟器粘連范圍分級(jí)對(duì)比（n）

2.2 VEGF和CD34在各組標(biāo)本中的表達(dá) 對(duì)照組大鼠賁門周圍組織VEGF主要表達(dá)在粘連組織成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿或胞膜上，數(shù)量較多，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；而實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少（見圖3），對(duì)照組大鼠賁門周圍組織 VEGF值高于實(shí)驗(yàn)組，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。

圖3 VEGF在賁門周圍粘連組織中的表達(dá)（×400）

同時(shí)通過CD34血管標(biāo)記物染色，對(duì)照組較多個(gè)體出現(xiàn)膠原纖維和彈性纖維增生均明顯，間質(zhì)中大量新生血管形成，數(shù)量繁多，管徑大小不等。實(shí)驗(yàn)組中個(gè)體纖維沉積較少，新生血管數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，管徑相對(duì)較細(xì)（見圖4）。

圖4 CD34在賁門周圍粘連組織中的表達(dá)（×400）

根據(jù)CD34在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)情況判定MVD，對(duì)照組MVD值為（14.47±2.89），實(shí)驗(yàn)組MVD值為（11.44±2.71），兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。對(duì)VEGF與MVD的直線相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈正相關(guān)（r=0.539，P＜0.05），即VEGF高表達(dá)的組織MVD呈現(xiàn)高趨勢(shì)（見表2）。

表2 VEGF及MVD在賁門周圍粘連組織中的表達(dá)及其相關(guān)性

3 討論

聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜是一種特殊的可吸收材料，手術(shù)后在體內(nèi)創(chuàng)面間使用該膜，可以減少創(chuàng)傷面之間的直接接觸，防止纖維組織細(xì)胞相互侵入，最大限度防止組織間不良粘連形成，預(yù)防術(shù)后創(chuàng)面粘連再生及新生血管形成。本研究在門靜脈高壓大鼠賁門周圍血管離斷術(shù)中應(yīng)用聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜包繞賁門周圍創(chuàng)面，觀察術(shù)后賁門周圍粘連及新生血管生成情況，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠賁門周圍組織粘連分級(jí)較對(duì)照組明顯降低，新生血管數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，進(jìn)而推斷在臨床門靜脈高壓患者賁門周圍血管離斷術(shù)中使用聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜包繞食管中下段、胃底，預(yù)防門奇靜脈側(cè)支循環(huán)再建立，降低術(shù)后食管中下段、胃底靜脈曲張破裂再出血的發(fā)生率的可能性。

賁門周圍血管離斷術(shù)是通過阻斷門奇靜脈間反常血流，達(dá)到控制門靜脈高壓癥引起的食管胃底靜脈曲張破裂出血，被推薦為外科治療門靜脈高壓癥首選的急診手術(shù)方式。然而該術(shù)式對(duì)食管、胃底的廣泛剝離會(huì)造成局部組織的粘連、新生血管形成，導(dǎo)致側(cè)支循環(huán)再次開放，引起食管中下段、胃底靜脈曲張破裂再出血［9］。Makdissi等［10］進(jìn)行臨床隨訪調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，賁門周圍血管離斷術(shù)后，5 a內(nèi)因食管中下段、胃底曲張靜脈破裂再出血的患者，在所有術(shù)后上消化道出血患者的比例達(dá)54.2％。因此賁門周圍血管離斷術(shù)后，減少賁門周圍組織粘連及新生血管形成，將對(duì)食管中下段、胃底靜脈曲張?jiān)傩纬缮踔疗屏言俪鲅獙?huì)產(chǎn)生一定預(yù)防作用。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組腹腔粘連宏觀分級(jí)較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），具體表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組粘連范圍小，所涉及的粘連組織、器官相對(duì)較少，說明聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜可有效降低賁門周圍血管離斷術(shù)后賁門周圍組織粘連形成。

大鼠賁門周圍血管離斷術(shù)后，在很多細(xì)胞、炎性因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等相互作用后，最終形成賁門周圍粘連組織，并伴隨著組織新生血管形成。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是同源二聚體糖蛋白，有單一基因編碼表達(dá)的，能夠直接激發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及分裂、分化，并增加微小血管的通透性，是目前文獻(xiàn)上公認(rèn)較強(qiáng)、研究較成熟的一種促血管生長(zhǎng)因子［11］。Rout等［12］研究發(fā)現(xiàn)，粘連組織中VEGF mRNA與VEGF蛋白較正常組織高表達(dá)，提示VEGF參與了粘連形成，VEGF在粘連組織中的表達(dá)與粘連程度存在相關(guān)性，隨著粘連程度增加而表達(dá)增強(qiáng)。CD34在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于非新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，提示其作用可能與血管生成有關(guān)，是目前最敏感的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物［13］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 VEGF與CD34從組織學(xué)角度評(píng)估賁門周圍粘連組織的粘連程度及新生血管情況。從免疫組織化學(xué)所呈現(xiàn)的結(jié)果看，兩組個(gè)體均存在不同程度粘連，對(duì)照組大鼠賁門周圍組織粘連較重，其VEGF表達(dá)明顯高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），同時(shí)對(duì)照組新生血管數(shù)目較實(shí)驗(yàn)組明顯增多（P＜0.05）。鑒于VEGF與血管生成的密切關(guān)系，我們同時(shí)研究了VEGF和MVD在粘連組織中的表達(dá)及相關(guān)性，VEGF高表達(dá)的對(duì)照組較低表達(dá)的實(shí)驗(yàn)組的MVD值明顯增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者存在正相關(guān)，從而提示粘連形成與血管發(fā)生之間存在密切關(guān)系，其可能通過VEGF的高表達(dá)而促進(jìn)新生血管生成。

綜上所述，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)研究，聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜在一定程度上可以預(yù)防、減少門脈高壓大鼠賁門周圍血管離斷術(shù)后粘連形成以及新生血管生成。由此推斷，對(duì)于臨床上門靜脈高壓患者，賁門周圍血管離斷術(shù)中應(yīng)用聚乳酸手術(shù)保護(hù)膜包繞賁門周圍創(chuàng)面，對(duì)于減少術(shù)后新生血管形成，進(jìn)而減少側(cè)支循環(huán)再開放，降低食管中下段及胃底靜脈曲張破裂再出血的發(fā)生率可能具有一定的治療效果。

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The application of polylactic acid operative protective film in the portal hypertension rat model of pericardial devascularization

CHEN Baoxing，XU Bing，ZHU Bingshuai

（Department of Hepatopancreatobiliary，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

Objective：To assess the effects of polylactic acid operative protective film in the portal hypertension ratmodel of pericardial devascularization.M ethods：40 SD rats were random ly divided into two groups，including the experimental group and the control group.The experimental group and the control group were made prehepatic portal hypertension model by partial portal vein ligation.The rats of experimental group underwent pericardial devascularization with polylactic acid operative protective film surrounding the cardia wound and the rats of control group were only operated by pericardial devascularization.Ratswere sacrificed after four weeks and specimens collected were made paraffin immunohistochem ical staining to observe the expression of CD34 and VEGF.Observe and analyse the cardiac peripheral tissue adhesion degree and neovascularizationthe.Resu lts：The control group had a wide range of adhesion in the macroscopic classification，while experimental group involved fewer adhesion and organs.The experimental group classification adhesion decreased significantly comparing with the control group and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Immunohistochemistry showed that the experimental group were lower than the control group in the degree of adhesion and angiogenesis of cases，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Polylactic acid operative protective film can prevent and reduce adhesion formation and angiogenesis in portal hypertension ratsmodel of pericardial devascularization in a certain extent.Polylactic acid operative protective film may be helpful to reduce rebleeding incidence in patients with portal hypertension after pericardial devascularization.

polylactic acid operative protective film；pericardial devascularization；VEGF；CD34

R 332

10.3969/j.issn.1004-437X2014.11.004

2014-06-30）

·臨床研究·