張建波，呂曉東，楚廣民，宋 魏，馮 穩(wěn)，劉明閣，于慶凱

（鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 病理科 河南 鄭州 450003）

乳腺癌T細(xì)胞受體α鏈全長(zhǎng)編碼序列多重PCR擴(kuò)增方法的建立

張建波，呂曉東，楚廣民，宋 魏，馮 穩(wěn)，劉明閣，于慶凱

（鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 病理科 河南 鄭州 450003）

目的：建立乳腺癌克隆性T細(xì)胞TCRα鏈全長(zhǎng)編碼序列（CDS）的多重PCR擴(kuò)增方法。方法：根據(jù)GenBank現(xiàn)有TCR序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增TCRα鏈32個(gè)亞家族上游引物35條，下游引物2條。對(duì)Mg2+、dNTPs和引物濃度比例以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系進(jìn)行TCRα鏈多重PCR擴(kuò)增，構(gòu)建重組質(zhì)粒并酶切鑒定。結(jié)果：擴(kuò)增出乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的TCRα鏈全長(zhǎng)編碼序列并構(gòu)建重組質(zhì)粒，5例患者共獲得23個(gè)陽(yáng)性克隆。結(jié)論：建立的TCRα鏈多重PCR擴(kuò)增方法具有特異、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可為研究乳腺癌克隆性T細(xì)胞提供幫助。

T細(xì)胞受體；多重PCR；質(zhì)粒

近年來(lái)，乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，約占女性惡性腫瘤的30％，占女性惡性腫瘤致死率的15％左右［1］。乳腺癌患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中存在針對(duì)腫瘤抗原特異反應(yīng)的T細(xì)胞克隆，分析這些克隆性增生的 T細(xì)胞，可以了解機(jī)體TCR亞家族限制性取用及CDR3譜型等機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答情況［2］。由于TCRα鏈由Vα-Jα-Cα基因片斷重排后編碼，構(gòu)成具有不同特異性的TCR分子，由此決定 T細(xì)胞識(shí)別抗原的多樣性和特異性，從而可對(duì)環(huán)境中千變?nèi)f化的抗原產(chǎn)生特異性應(yīng)答［3］。本研究的目的是建立特異、快速、簡(jiǎn)便的多重PCR擴(kuò)增方法擴(kuò)增TCRα鏈全長(zhǎng)編碼序列，為分析乳腺癌患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中克隆性增生 T細(xì)胞的特點(diǎn)等進(jìn)一步研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本 選取河南省腫瘤醫(yī)院確診為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（組織學(xué)II級(jí)）住院患者5例，均為女性，年齡28～73歲，經(jīng)術(shù)中快速冰凍檢查明確腋窩前哨淋巴結(jié)有癌微轉(zhuǎn)移標(biāo)本。同時(shí)取2例反應(yīng)性增生淋巴結(jié)標(biāo)本作為對(duì)照。

1.2 材料 TRIzol、SuperScript III Reverse Transcriptase（美國(guó)Invitrogen公司），Advantage 2 Polymerase M ix（美國(guó)BD公司），Taq DNA Polymerase、Restriction Endonucleases（Xbal、EcoRⅠ、KpnⅠ）、T4 DNA Ligase、pGEM-7Zf（+）Vector（美國(guó)Promega公司），E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit（美國(guó)Omega公司），QIAEX II Gel Extraction Kit（德國(guó)QIAGEN公司），PCR儀（美國(guó)MJ research公司）。

1.3 RNA提取及cDNA合成 將癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)周圍的淋巴組織及對(duì)照組淋巴結(jié)標(biāo)本在200目篩網(wǎng)上進(jìn)行研磨后用PBS進(jìn)行沖洗，收集細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，提取總RNA合成20μl cDNA。

1.4 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank現(xiàn)有TCR序列設(shè)計(jì)TCRα鏈的上游引物35條，下游引物2條［4］。上游引物分別引入KpnⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，下游引物引入 Xbal限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。并將TCRα鏈終止密碼TGA改為TAA以避免甲基化（引物由上海英俊生物技術(shù)公司合成）。

1.5 多引物PCR分別擴(kuò)增TCRα鏈全長(zhǎng)序列 根據(jù)退火溫度不同分為 7組，每組引物 4～12對(duì)。各PCR反應(yīng)體系中引物濃度、退火溫度及Mg2+濃度分別經(jīng)梯度PCR進(jìn)行優(yōu)化，引物終濃度是10μmol/L，Mg2+終濃度1.5 mmol/L，退火溫度在50～65℃?？偡磻?yīng)體系50μl，其中10×Buffer 5μl，MgCL23μl，dNTP 1μl，上、下游混合引物各0.5μl，cDNA 1μl，Taq酶（5u/μl）0.5μl，各反應(yīng)體系引物終濃度是10μmol/L，Mg2+終濃度1.5 mmol/L。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5 min；95℃40 s，50～65℃1 min，72℃1 m in 50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物上1％瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 構(gòu)建重組質(zhì)粒及酶切鑒定 PCR陽(yáng)性產(chǎn)物純化回收后經(jīng)Kpn I和Xbal、EcoRI和Xbal酶切，與相應(yīng)酶切質(zhì)粒pGEM-7Zf（+）進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109，挑取氨芐青霉素抗性菌落，增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切并上1％瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果

2.1 TCRα鏈全長(zhǎng)序列的多重PCR擴(kuò)增 將多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上1％瓊脂糖凝膠電泳，部分?jǐn)U增體系在800 bp左右有目的條帶，對(duì)照組反應(yīng)性增生淋巴結(jié)標(biāo)本各反應(yīng)體系均有擴(kuò)增，見圖1。

1～5：TCRα鏈多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；6：陰性質(zhì)控；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 重組質(zhì)粒的PCR、酶切鑒定 陽(yáng)性克隆酶切電泳可見兩條泳動(dòng)速度不同的條帶，分別與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和空質(zhì)粒雙酶切后的大小一致，見圖2。經(jīng)鑒定5例患者分別獲得陽(yáng)性克隆數(shù)為5個(gè)、4個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、5個(gè)，共23個(gè)陽(yáng)性克隆。

圖2 TCRα鏈PCR產(chǎn)物及重組質(zhì)粒酶切鑒定

3 討論

TCR是T細(xì)胞表面的抗原受體，參與抗原的特異性識(shí)別。編碼TCRα鏈的基因由許多不連續(xù)的可變區(qū)基因（AV），連接基因（AJ）和恒定區(qū)基因（AC）組成。根據(jù)TCR AV核苷酸同源性是否大于75％，可以把TCR AV分為32個(gè)功能性基因家族。AV基因片段的下游有50～70個(gè)AJ基因片段和1個(gè)AC基因片段［3］。分析乳腺癌患者體內(nèi) T細(xì)胞的克隆性增生情況及其CDR3譜型，可反映特定T細(xì)胞克隆擴(kuò)增的程度及T細(xì)胞抗腫瘤免疫功能狀態(tài)［5］。

本研究建立克隆性T細(xì)胞的多重PCR方法，擴(kuò)增TCRα鏈全長(zhǎng)序列，具有快速、特異、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。但是多重PCR并非單一引物對(duì)PCR的簡(jiǎn)單組合，其中Mg2+、dNTPs、引物濃度、退火溫度、酶的用量以及循環(huán)條件等均需進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)梯度PCR摸索反應(yīng)條件，顯示較低引物濃度可減少非特異條帶的擴(kuò)增。適當(dāng)降低退火溫度，延長(zhǎng)變性、退火、延伸時(shí)間，增加變性溫度、循環(huán)時(shí)間和循環(huán)次數(shù)可以有效地增加PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，而Mg2+、dNTPs的濃度、酶的用量則與單獨(dú)擴(kuò)增時(shí)相似。

利用該方法對(duì)5例乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)TCRα鏈進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定共獲得23個(gè)陽(yáng)性T細(xì)胞克隆，與PCR-序列分析方法相比一定程度上減少了工作量，由于擴(kuò)增的是TCRα鏈全長(zhǎng)編碼序列，可進(jìn)一步完整地分析所有核苷酸和氨基酸序列，擴(kuò)增的序列還可用于體外表達(dá)，避免了PCR-GeneScan（基因掃描）-序列分析［6］只擴(kuò)增 TCR部分序列的不足，而且不受CDR3長(zhǎng)度的影響，為研究腫瘤相關(guān)T細(xì)胞克隆，以及分析其TCR基因重排和CDR3譜型等打下了基礎(chǔ)。

［1］Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer Statistics［J］.CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.

［2］張建波，宋永平，于慶凱，等.乳腺癌患者T細(xì)胞受體基因重排及CDR3區(qū)序列分析［J］.腫瘤研究與臨床，2010，22（3）：179-181.

［3］Srivastava S K，Robins H S.Palindromic nucleotide analysis in human T cell receptor rearrangements［J］.PLoS One，2012，7（12）：e52250.

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Establishment of M ulti-PCR to am p lify the com plete DNA sequence of TCRαchains in patients w ith breast cancer

ZHANG Jianbo，LV Xiaodong，CHU Guangm in，SONG Wei，F(xiàn)ENG Wen，LIU Mingge，YU Qingkai
（Department of Pathology，the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450003，China）

Objective：To establish a method of Multi-PCR to amplify the complete DNA sequence（CDS）of TCRαchains of clonal T cells in patientswith breast cancer.M ethods：The specific 35 upstream primers and 2 downstream primers for 32 subfam ilies were designed according to the sequences of TCRαchains provided by GeneBank.The multiplex PCR reaction system and condition was optimized to find out the best concentration of Mg2+，dNTPs and primers，and the best annealing temperature.The CDS of TCRαchains were amplified and then inserted into cloning vector.The recombinant constructs were identified by the endonucleases.Resu lts：The CDS of TCRαchains were amplified，and constructed the recombinant plasmid.There were 23 positive clones were received in 5 patients with breast cancer.Conclusion：Multi-PCR established in the study is specific，rapid，simple and convenient.It provides the technical support to analyse the Feature of clonal T cell in patients with breast cancer.

T-cell antigen receptor（TCR）；Multi-PCR；plasmid

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（102300410038）。

于慶凱，E-mail：yuqingkai@hot.mail。

R 737.9

10.3969/j.issn.1004-437X2014.11.002

2014-06-15）