馮 瀟，楊成梁，鄭曉麗，翟沖亞，趙慧云，葛 紅

（鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 放療科 河南 鄭州 450008）

siRNA靶向沉默HIF-1α基因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的影響

馮 瀟，楊成梁，鄭曉麗，翟沖亞，趙慧云，葛 紅

（鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 放療科 河南 鄭州 450008）

目的：探討質(zhì)粒介導(dǎo)RNA干擾抑制HIF-1α基因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。方法：利用基因工程方法構(gòu)建HIF-1α的干擾表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染至肺腺癌A549細(xì)胞；分別用RT-PCR方法、Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后HIF-1α以及MMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)的變化。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后肺腺癌A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后肺腺癌A549細(xì)胞中HIF-1α和MMP-2的mRNA表達(dá)分別下降86％和64％（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞蛋白表達(dá)明顯下降。轉(zhuǎn)染前后穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（135.2±13.2）、（63.7±10.5），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染前后劃痕寬度分別為（0.48±0.14）、（1.04±0.15）mm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：RNAi可有效抑制HIF-1α的表達(dá)，同時(shí)可結(jié)合MMP-2啟動(dòng)子下調(diào)MMP-2基因和蛋白的表達(dá)，降低肺癌A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。關(guān)鍵詞：RNA干擾；乏氧誘導(dǎo)因子；基質(zhì)金屬蛋白酶-2

低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧的核心轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在腫瘤的血管形成、能量代謝、侵襲轉(zhuǎn)移等方面扮演重要角色，是在低氧環(huán)境中起到中樞紐帶的重要轉(zhuǎn)錄因子［1］，也是參與多種腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)的調(diào)節(jié)通路?；|(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）是一種能降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的蛋白水解酶，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［2］。近年來開展的RNA干擾技術(shù)是指具有同源性的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）能高效特異地使靶mRNA發(fā)生降解、使基因轉(zhuǎn)錄后的mRNA不能表達(dá)而導(dǎo)致基因沉默的一種現(xiàn)象，為研究?jī)?nèi)源性基因功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了有效的技術(shù)手段。本研究旨在通過構(gòu)建可表達(dá)人HIF-1α基因siRNA的真核重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人肺腺癌 A549細(xì)胞，觀察HIF1-α基因沉默對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞MMP-2基因表達(dá)的影響，以及轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 人肺腺癌A549細(xì)胞株購自上海細(xì)胞研究所，pSilencer2.1質(zhì)粒購自Ambion公司，RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清購于美國(guó)Gibco公司。Trizol試劑、RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、RTPCR擴(kuò)增試劑盒購于德國(guó)Qiagen公司。HIF-1α、MMP-2和GAPDH引物由北京金唯智公司合成。兔抗人HIF-1α單克隆抗體和兔抗人MMP-2多克隆抗體購自ABCAM公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物公司。Western blot相關(guān)試劑是北京康為世紀(jì)公司產(chǎn)品。使用的實(shí)驗(yàn)儀器主要有：細(xì)胞培養(yǎng)箱，熒光定量PCR儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：A549細(xì)胞在含有100 m l/L胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，置于37℃，95％飽和濕度、含5％CO2的孵箱中培養(yǎng)，每1～2 d換1次液，于細(xì)胞80％融合時(shí)，用0.25％的胰酶細(xì)胞消化液消化，1∶2或1∶3傳代1次。

1.2.2 HIF-1α基因RNAi寡核苷酸的合成：利用shRNA設(shè)計(jì)軟件，針對(duì)HIF-1α靶基因序列，按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則，選取特異性的序列5'-GTGATGAAAGAATTACCGAAT-3'，同時(shí)選取一條非特異性干擾序列5'-CCAGTTATGATTGTGAAGTTA-3'。并引入BamHⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)以確保引物退火后可以插入質(zhì)粒pSilencer2.1且讀框正確。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pSilencer2.1，酶切產(chǎn)物膠回收并溶于超純水中，ATM基因RNAi寡聚核苷酸退火后以3∶1的比例與膠回收質(zhì)粒進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α中。次日隨機(jī)挑取菌落，接種LB培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)過夜，堿裂解法小量快速抽提質(zhì)粒，并用pSilencer2.1特有的測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。非特異siRNA寡聚DNA與pSilencer2.1質(zhì)粒的連接、克隆同上。置于37℃，95％飽和濕度、含5％CO2的孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度為80％時(shí)，胰酶消化收取細(xì)胞并分別加入上述構(gòu)建好的重組質(zhì)粒，電穿孔法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，48 h后收取細(xì)胞待用。實(shí)驗(yàn)分為3組：實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染pSilencer2.1-HIF-1α質(zhì)粒）、空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pSilencer2.1-nonspecific質(zhì)粒）。

1.2.4 總RNA提?。簩?shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組分別接種入六孔板中，放入37℃，95％飽和濕度、含5％CO2的孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80％時(shí)使用RNA提取試劑盒提取總RNA。

1.2.5 RealTime RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：常規(guī)合成cDNA第一鏈，以此第一鏈為模板，PCR擴(kuò)增MMP-2及HIF-1αmRNA片段，同時(shí)擴(kuò)增三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參照，目的基因、內(nèi)參引物序列和PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見表1，表2。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 HIF-1α和MMP-2基因引物序列

表2 HIF-1α和MMP-2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

1.2.6 Western blot檢測(cè)HIF-1α和MMP-2蛋白的表達(dá)：蛋白裂解液裂解細(xì)胞，冰上放置20 min，12 000轉(zhuǎn)離心20 min，取上清液。BCA法蛋白定量試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度；使用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制膠，每個(gè)泳道蛋白的上樣量均為14μl，于SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5％無脂牛奶（TBST配制）封閉1 h。加一抗后4℃冷室中封閉過夜，HIF-1α、MMP-2效價(jià)均為1∶1 000。TBST洗膜3次，每次15 min。HRP標(biāo)記的二抗（山羊抗兔為1∶2 000）室溫下置于搖床上搖動(dòng)孵育1 h。用TBST洗膜3次，每次15 min。應(yīng)用ECL化學(xué)顯色試劑盒（A液∶B液=1∶1）顯色，并于暗室中顯影。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×105個(gè)/m l接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)至細(xì)胞匯合（80％～90％滿），形成單細(xì)胞層。用無菌200μl的槍頭在細(xì)胞上垂直劃過形成一無細(xì)胞的細(xì)痕，PBS清洗3遍，去除漂浮細(xì)胞，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，4％多聚甲醛固定后顯微鏡下觀察。通過觀察劃痕寬度變化來判斷遷移能力。

1.2.8 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：聚碳酸脂微孔濾膜上鋪Matrigel凝膠（8.4 mg/m l）50μl包被30 h，風(fēng)干。將500μl含 10％FBS的1640完全培養(yǎng)基加入下層小室；細(xì)胞用無血清的1640培養(yǎng)基制成1×105個(gè)細(xì)胞/m l的細(xì)胞懸液，各取200μl移入小室，培養(yǎng)24 h后剪下聚碳酸脂微孔濾膜，以4％多聚甲醛固定侵襲并黏附至下室面的細(xì)胞。常規(guī)HE染色。每張膜中央部分和周圍部分各隨機(jī)取5個(gè)視野（×200倍）。計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，以每個(gè)視野的平均數(shù)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示各組數(shù)據(jù)，兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染48 h，通過在熒光顯微鏡下觀察可見視野內(nèi)EGFP細(xì)胞個(gè)數(shù)與所有細(xì)胞的比率，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的轉(zhuǎn)染效率分別是（93.0± 4.2）％、（91.0±3.5）％。見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的轉(zhuǎn)染效率比較

2.2 siRNA導(dǎo)入A549細(xì)胞對(duì)H IF-1α和MM P-2基因m RNA表達(dá)水平的影響 行Real-Time PCR，經(jīng)2-△△ct法計(jì)算各組HIF-1α及MMP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組HIF-1α及MMP-2的mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組分別下降了86％和64％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 siRNA導(dǎo)入A549細(xì)胞對(duì)H IF-1α和MM P-2基因蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組HIF-1α與MMP-2蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組均有明顯下降，陰性對(duì)照組HIF-1α與MMP-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組無差異。見圖3。

2.4 siRNA導(dǎo)入A549細(xì)胞對(duì)其遷移能力的影響

空白對(duì)照組寬度為（0.48±0.14）mm，實(shí)驗(yàn)組為（1.04 ±0.15）mm，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性對(duì)照組為（0.61±0.11）mm，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4、圖5、圖6。

2.5 siRNA導(dǎo)入A549細(xì)胞對(duì)其侵襲能力的影響

空白對(duì)照組穿膜數(shù)為（135.2±13.2），實(shí)驗(yàn)組為（63.7± 10.5），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（129.6±16.3），與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組HIF-1α與MMP-2的mRNA表達(dá)情況比較

圖3 空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組中HIF-1α與MMP-2的蛋白表達(dá)對(duì)比

圖4 空白對(duì)照組細(xì)胞24 h劃痕對(duì)比（左側(cè)為初始劃痕，右側(cè)為培養(yǎng)24 h后的劃痕）

圖5 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞24 h劃痕對(duì)比（左側(cè)為初始劃痕，右側(cè)為培養(yǎng)24 h后的劃痕）

圖6 陰性對(duì)照組細(xì)胞24 h劃痕對(duì)比（左側(cè)為初始劃痕，右側(cè)為培養(yǎng)24 h后的劃痕）

3 討論

肺癌是當(dāng)今世界上發(fā)病率增長(zhǎng)最快和死亡率最高的惡性腫瘤之一，治療失敗的原因主要為局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要因素之一是腫瘤細(xì)胞中乏氧細(xì)胞的生成。研究顯示，當(dāng)腫瘤體積大于1 mm時(shí)，自身的血液供應(yīng)就不能滿足腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)的需要，使其內(nèi)部處于相對(duì)低氧的環(huán)境中，低氧能使很多基因轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生改變，其基因產(chǎn)物可引起腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一系列病理生理、生化改變，增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的能力，其中的關(guān)鍵是使HIF-1α基因表達(dá)量增高，有研究顯示HIF-1α表達(dá)與胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。HIF-1α是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中的重要基因，其表達(dá)受到氧分壓的調(diào)控，細(xì)胞低氧可激活HIF-1α基因，使其表達(dá)量增加，參與到多個(gè)調(diào)節(jié)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路中［3-4］，同時(shí)也使細(xì)胞免受乏氧的傷害［5］。HIF-1α還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一系列基因做出應(yīng)答反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境中保持能量供應(yīng)。Ji等［4］發(fā)現(xiàn)在乏氧條件下，HIF-1α通過調(diào)控LOX-FAK/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，從而能促進(jìn)卵巢癌的轉(zhuǎn)移，加大治療難度。本研究通過質(zhì)粒載體將HIF-1α基因的干擾序列轉(zhuǎn)染到肺腺癌A549細(xì)胞中，使HIF-1α基因mRNA及蛋白表達(dá)水平下降，觀測(cè)MMP-2基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。

本研究通過Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)陽性組細(xì)胞MMP-2的mRNA和蛋白表達(dá)較陰性組與對(duì)照組細(xì)胞有明顯下降，證明通過RNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建了HIF-1α低表達(dá)細(xì)胞，同時(shí)MMP-2基因mRNA與蛋白表達(dá)也下降，說明其在HIF-1α在MMP-2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。MMP-2基因與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，在惡性腫瘤組織中有較高的表達(dá)［6-7］，基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)越高，腫瘤預(yù)后越差［8］。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的潛能與腫瘤細(xì)胞表達(dá)MMP-2的能力呈正相關(guān)，MMP-2高表達(dá)與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)，HIF-1α的高表達(dá)可促進(jìn)MMP-2蛋白的表達(dá)［9］。MMP-2基因能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞基底膜等物理屏障，重塑細(xì)胞間黏附力并促進(jìn)腫瘤新血管形成，從而導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Choi等［6］報(bào)道，使用腺病毒的shRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株降低HIF-1α基因表達(dá)后，肝癌細(xì)胞中MMP-2表達(dá)降低，肝癌細(xì)胞的侵襲和生長(zhǎng)能力顯著降低。有研究顯示降低MMP-2基因表達(dá)后，可使乳腺癌細(xì)胞的侵襲性受到抑制［10］。

Transwell小室是目前常用的Matrigel膠重建基膜系統(tǒng)，是體外研究腫瘤細(xì)胞侵襲行為的簡(jiǎn)便和快速有效的方法，腫瘤細(xì)胞穿過Matrigel膠的能力能夠反應(yīng)細(xì)胞的侵襲能力。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組穿膜數(shù)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯下降，可以證實(shí)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力下降。本研究通過劃痕實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了上述結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞24 h后劃痕的寬度明顯大于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力下降。

總之，通過 RNA干擾技術(shù)靶向沉默肺癌細(xì)胞HIF-1α基因可降低MMP-2基因的表達(dá)，減弱肺癌A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，而且MMP2和HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)。選擇性抑制腫瘤細(xì)胞中HIF-1α基因表達(dá)將為降低腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，為抑制和延緩腫瘤治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供重要思路與途徑。

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Effect of silence of HIF-1αexpression by siRNA on invasion and metastasis of human lung adenocarcinoma A549 cells

FENG Xiao，YANG Chengliang，ZHENG Xiaoli，ZHAIChongya，ZHAO Huiyun，GE Hong
（Department of Radiation Oncology，the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450003，China）

Objective：To investigate the effect of silence of HIF-1αexpression by p lasmid-mediated RNA interference on the invasion and metastasis of human lung adenocarcinoma A549 cells.M ethods：The interference carrier of HIF-1αexpression was constructed by using genetic engineeringmethods，and transfected into lung adenocarcinoma cell line A549.The expressions of HIF-1α and MMP-2 mRNA were detected by PCR.The proteins of them before and after cell transfection were detected by western blot.The functional of migration and invasion were detected by the scratch test and transwell assay before and after cell transfection.Resu lts：After cell transfection，the HIF-1αand MMP-2 mRNA expressions were decreased by 86％and 64％（P＜0.05）.After transfection，protein expressions were significantly decreased.The number of penetrating cells was（135.2±13.2）before transfection and（63.7±10.5）after transfection，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The scratch width was（0.48±0.14）mm，（1.04±0.15）mm respectively，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：RNA interference could effectively inhibit the expression of HIF-1α，decrease mRMA and protein levels of MMP-2 by attaching to its gene promoter，inhibit the metastasis and invasion of A549 cells.

RNA interference；HIF-1α；MMP-2

葛紅，E-mail：gehong666@126.com。

R 734.2

10.3969/j.issn.1004-437X2014.11.001

河南省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目（124300510016）；鄭州市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（121PCXTD524）。

2014-06-27）