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(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 省部共建中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410007)

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超微四神丸對(duì)泄瀉模型大鼠T細(xì)胞亞群的影響

蔡瑩1，藺曉源2，鄧娜1

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 省部共建中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410007)

目的 觀察超微四神丸對(duì)泄瀉模型大鼠T細(xì)胞亞群的影響，探討超微四神丸治療泄瀉的免疫學(xué)機(jī)制。方法 將40只SD大鼠隨機(jī)分組，按參考文獻(xiàn)[2]制備脾腎陽虛泄瀉模型，各組給予不同處理后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的變化情況。結(jié)果 模型組外周血CD3+、CD4+細(xì)胞百分比降低,與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，CD8+細(xì)胞百分比較正常組升高(P<0.05),CD4+/CD8+比值明顯低于正常組(P<0.05)。四神丸湯劑組和超微組上述指標(biāo)均有改善,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),且超微組在調(diào)節(jié)CD4+和CD8+水平上優(yōu)于湯劑組(P<0.05)。結(jié)論 超微四神丸對(duì)泄瀉大鼠的作用與調(diào)節(jié)外周血T細(xì)胞亞群水平有關(guān)。

超微四神丸；泄瀉；T細(xì)胞亞群；大鼠

脾和腎為中醫(yī)藏象體系中重要的兩臟，“腎為先天之本，脾為后天之本”，且認(rèn)為兩臟關(guān)系密切，但脾腎兩臟是否確實(shí)存在相關(guān)性，其現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)是什么，是值得深入探討的一個(gè)課題。目前研究發(fā)現(xiàn)，脾虛證、腎虛證都有不同程度的免疫功能低下，免疫功能可能是脾腎相關(guān)的一種重要生理機(jī)制。脾腎相關(guān)的病理證候是脾腎陽虛[1]，而四神丸是治療脾腎陽虛型泄瀉的經(jīng)典名方，本研究從免疫功能研究超微四神丸對(duì)脾腎陽虛模型動(dòng)物的干預(yù)效應(yīng)，運(yùn)用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)探討超微四神丸對(duì)模型大鼠外周血中T細(xì)胞亞群的影響,揭示其調(diào)節(jié)機(jī)制和作用靶點(diǎn)，以期為研究脾腎相關(guān)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量280～300 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，許可證號(hào):SCXK(湘)2009-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 四神丸(補(bǔ)骨脂、肉豆蔻、五味子、吳茱萸、大棗、生姜)按2005年《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的藥物配比(4∶2∶2∶1∶2∶2)組方。四神丸水煎劑和超微劑型均由湖南中醫(yī)藥研究院超微中心提供,生藥含量0.5 g/mL；200%的大黃濃縮水煎液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器 小鼠抗大鼠CD3-FITC(異硫氰酸熒光素)、小鼠抗大鼠CD4-FITC、小鼠抗大鼠CD8b-FITC均由長(zhǎng)沙麗欣生物技術(shù)有限購(gòu)公司代購(gòu)。GL20A高速冷凍離心機(jī)(湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼公司)。

1.4 動(dòng)物造模 按參考文獻(xiàn)[2]，造模分2個(gè)階段完成:第一階段灌服(200%)大黃水煎液2 mL復(fù)制脾虛模型;第2階段在脾虛基礎(chǔ)上肌肉注射氫化可的松25 mg/(kg·d)復(fù)制腎虛模型。

1.5 分組與給藥 所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)抽取10只作為正常組，其余開始造模，造模成功后，再隨機(jī)分為模型組、四神丸湯劑組和超微四神丸組，每組10只。四神丸湯劑組給予四神丸湯劑灌胃，超微四神丸組給予四神丸超微溶液，模型組給予蒸餾水，灌胃劑量均為臨床等效劑量，連續(xù)用藥14 d，正常組常規(guī)喂養(yǎng)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè) 大鼠末次給藥后用10%水合氯醛(4.0 mL/kg)麻醉，腹主動(dòng)脈取血2 mL直接置于預(yù)冷的試管內(nèi)，4 ℃離心(3 500 r/min)10 min，取上層血清置-30 ℃冰箱保存待測(cè)。流式檢測(cè)T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+百分比，并計(jì)算CD4+/CD8+比值。

2 結(jié)果

各組大鼠外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值變化比較 見表1。

表1 各組大鼠外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值變化

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與四神丸湯劑組比較，▲P<0.05。

3 討論

脾腎相關(guān)理論起源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》。《素問·五臟生成篇》曰：“腎之合骨也，其榮發(fā)也，其主脾也”。在中醫(yī)藏象理論中，脾陽根于腎陽，脾的陰陽皆以腎水腎火為根蒂。脾陽賴腎陽溫煦而生化精微，脾土得腎水濡養(yǎng)而健運(yùn)不息?！端貑枴ば魑鍤馄吩唬骸捌橄选薄澳I為唾”，而現(xiàn)代研究[3-4]表明，“涎”“唾”為脾腎所共主。脾氣虛證、腎虛證都有不同程度的免疫功能低下及內(nèi)分泌紊亂。

脾腎陽虛瀉又稱“五更泄”，屬現(xiàn)代醫(yī)學(xué)非特異性潰瘍性結(jié)腸炎、慢性腹瀉的范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，五更瀉多因泄瀉日久，導(dǎo)致脾腎陽虛所致。治宜溫腎暖脾為主。四神丸由《普濟(jì)本事方》的二神丸與五味子散兩方組合而成，有溫腎暖脾、固腸止瀉之效。

腸道免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有賴于免疫細(xì)胞、免疫因子及免疫球蛋白的參與，因此脾腎陽虛泄瀉發(fā)病涉及T細(xì)胞亞群及炎癥介質(zhì)的變化。T細(xì)胞亞群中CD4+(輔助性T淋巴細(xì)胞)具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的活性，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，分泌細(xì)胞因子的作用；而CD8+(抑制性T淋巴細(xì)胞)則有免疫抑制和細(xì)胞毒性作用。CD4+/CD8+比值正常情況下相對(duì)穩(wěn)定,維持機(jī)體細(xì)胞免疫功能。如果兩者比例失衡可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能缺陷[4]。研究[5]顯示：肝郁脾虛兼心神不寧型腹瀉型IBS患者存在免疫功能紊亂,表現(xiàn)為外周血CD3+無異常，CD4+明顯低于正常，CD8+則高于正常,CD4+/CD8+比值明顯下降,說明腹瀉型IBS存在外周血T細(xì)胞亞群的異常。研究[6]證實(shí)，脾氣虛證模型大鼠外周血T淋巴細(xì)胞總數(shù)(CD3+細(xì)胞)減少，T細(xì)胞亞群變化見CD4+T細(xì)胞降低，CD8+T細(xì)胞不變或升高，CD4+/CD8+比值降低,脾臟T細(xì)胞增值反應(yīng)降低。外周血CD4+計(jì)數(shù)CD4+/CD8+比值降低[7]。李慶陽等[8]分析了老年腎虛患者T淋巴細(xì)胞亞群變化，發(fā)現(xiàn)CD3+和CD4+顯著下降，CD8+顯著升高。

本研究結(jié)果顯示，模型大鼠CD3+、CD4+細(xì)胞百分比降低，CD8+細(xì)胞百分比升高,CD4+/CD8+比值明顯低于正常組，表明模型大鼠發(fā)生了免疫功能的紊亂。四神丸湯劑組和超微組上述指標(biāo)均較模型組有所改善(P<0.05或P<0.01)，且超微組調(diào)節(jié)CD4+和CD8+的作用優(yōu)于湯劑組(P<0.05),表明四神丸可能通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的變化而到達(dá)調(diào)節(jié)自身免疫功能的目的，其超微劑型療效更為明顯，同時(shí)也揭示出通過以方測(cè)證研究脾腎相關(guān)思路的合理性。

[1]趙慧,榮向路,陳芝喜.脾虛、腎虛證及脾腎相關(guān)的客觀化研究[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(47):130-135.

[2]王立峰,陳芝喜,趙慧,等.強(qiáng)肌健力方對(duì)脾腎兩虛證大鼠血漿性激素水平的影響[J].放射免疫學(xué)雜志,2008,21(2):147-149.

[3]駱麗娟,黃文宜.脾腎相關(guān)的證型實(shí)驗(yàn)研究概況[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,6(6):49，57.

[4]竇榮華.免疫細(xì)胞學(xué)與疾病[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2004:893.

[5]程宏輝,周福生.順激方治療腸易激綜合征30例及對(duì)T細(xì)胞亞群的影響[J].陜西中醫(yī),2009,30(7):835-836.

[6]樊雅莉.大鼠脾氣虛模型初步規(guī)范化的部分細(xì)胞免疫功能研究[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2002,8(10):63-64.

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EffectsofultrafinesishenpillonTlymphocytesubsetinthemodelofdiarrheasyndromerats

CAI Ying1,LIN Xiaoyuan2,DENG Na1

(1.TCM University of Hunan,Changsha 410208,China；2.Key Laboratory of Internal Medicine Traditional Chinese Medicine University of Hunan,Changsha 410007,China)

ObjectiveTo observe the effects ofUltrafineSishenPillon T lymphocyte subset in the model of diarrhea Syndrome rats,and to explore the immunological mechanism ofUltrafineSishenPillon diarrhea.Methods40 SD rats were divided into different groups randomly.Prepare spleen-kidney Yang deficiency of diarrhea model.Each group was giving different treatments,CD3+、CD4+、CD8+of T lymphocyte cell subset were measured by flow cytometer.ResultThe percentage of CD3+、CD4+in peripheral blood of model group was decreased,the difference was significant compared with the normal group(P<0.05 orP<0.01).The percentage of CD8+of model group was increased,compared with the normal group(P<0.05),the ratio of CD4+/CD8+was lower than the normal group(P<0.05).The above-mentioned indexes of Sishen Pill decoction group and Ultrafine group were improved,compared with model group they had a significant difference (P<0.05 orP<0.01),and Ultrafine group in the reduction of CD4+and CD8+was superior to the decoction group.ConclusionEffects of Ultrafine Sishen Pill on diarrhea Syndrome in rats are possibly associated with T Lymphocyte subset.

UltrafineSishenPill;Diarrhea;T Lymphocyte subset;rats

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.01.005

湖南省教育廳科研項(xiàng)目資助課題(11C0960)。

蔡 瑩(1982-)，女，博士，講師。研究方向：中醫(yī)藥防治消化系統(tǒng)疾病。

R285.5

：A

2095-6258(2014)01-0012-03

2013-09-04)