楊蘭 胡洪林 鄧穎 白義鳳

小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）的細(xì)胞倍增時(shí)間短，病情進(jìn)展快，早期即發(fā)生血道和淋巴道轉(zhuǎn)移，惡性程度在所有肺癌類型中最高。SCLC的治療以放化療為主，盡管80%患者早期對(duì)放、化療呈現(xiàn)出較好的初始反應(yīng)性，但很快即產(chǎn)生復(fù)發(fā)或病情進(jìn)展。局限期患者5年生存率低于30%，廣泛期患者5年生存率僅1%-2%[1]。SCLC的耐藥，尤其是多藥耐藥（multi-drug resistance, MDR）的產(chǎn)生是其治療失敗的最重要原因[2]。因此，化療抗藥已成為目前SCLC臨床治療急需解決的問題之一。

鞘氨醇激酶-1（sphingosine kinase-1, SPHK1）是一種鞘氨醇代謝酶，于1998年首先在大鼠腎細(xì)胞中被提取出來，相對(duì)分子質(zhì)量為49,000。目前己發(fā)現(xiàn)，在人類和小鼠組織中存在Sphkl和Sphk2兩種異構(gòu)體。人類細(xì)胞中，Sphkl基因位于17號(hào)染色體，Sphk2位于19號(hào)染色體。Sphkl和Sphk2有著不同的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制。SPHK1分子主要分布在腦、心臟、肺臟、肝臟、脾臟和造血免疫系統(tǒng)，與多種腫瘤細(xì)胞的過度增殖有關(guān)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。SPHK1的過度表達(dá)能夠提高細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)化的速率，減少細(xì)胞倍增的時(shí)間，從而對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控發(fā)揮作用[3]。研究人員[4]在前列腺癌方面的研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)SPHK1的表達(dá)能降低羥喜樹堿誘導(dǎo)的前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡。Sobue等[5]的研究發(fā)現(xiàn)SPHK1由于其在白血病患者中呈高表達(dá)，因此SPHK1既是預(yù)測(cè)白血病對(duì)柔紅霉素敏感性的一個(gè)好的標(biāo)志物，又是一個(gè)白血病的潛在治療靶點(diǎn)，在柔紅霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，SPHK1可能與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但SPHK1對(duì)腫瘤耐藥方面的研究還很少見，尤其在SCLC耐藥中的作用目前國(guó)內(nèi)外還未見相關(guān)的報(bào)道。我們前期通過基因表達(dá)譜芯片對(duì)SCLC耐藥細(xì)胞H69AR和非耐藥細(xì)胞H69中21,522個(gè)基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H69AR細(xì)胞中1,131個(gè)基因表達(dá)下調(diào)[6]，包含SPHK1在內(nèi)的1,252個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步驗(yàn)證SPHK1在SCLC敏感和耐藥患者及細(xì)胞株中的差異表達(dá)，以及其表達(dá)對(duì)SCLC化療藥物敏感性、細(xì)胞周期、凋亡及臨床預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 76例SCLC患者化療前外周血液標(biāo)本均來源于2007年1月-2013年10月四川省人民醫(yī)院腫瘤科及呼吸內(nèi)科，將其分為化療敏感組（化療5個(gè)-6個(gè)周期后腫瘤完全緩解或部分緩解）36例，化療耐藥組（化療5個(gè)-6個(gè)周期后疾病穩(wěn)定或進(jìn)展者）40例，采用Dextran沉降法、標(biāo)準(zhǔn)的梯度密度離心的方法分離SCLC血液標(biāo)本中有核細(xì)胞[7]，具體步驟如下：使用無菌采血針抽取SCLC外周靜脈血至真空采血管（含EDTA抗凝）中，加入二分之一體積的6% DextranT-500/0.9% NaCl緩慢顛倒混勻，37oC水浴沉降30 min-45 min。待沉降完全后，小心將上層富血清吸入離心管中，2,500 rpm/min離心30 min；去上清，收集管底沉淀，加入Trizol 1 mL移入去RNA酶的EP管中，放-80oC保存。76例患者均接受EP方案［足葉乙甙（VP 16）加順鉑（DDP）］化療，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。隨訪：全部76例患者出院后均隨訪，隨訪方式為電話隨訪和復(fù)查隨訪，隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀及影像學(xué)檢查。隨訪起點(diǎn)為確診日期，末次隨訪時(shí)間為2014年1月31日，中位隨訪時(shí)間約24個(gè)月，至隨訪截止日，依然生存34例，死亡42例，無失訪病例。

1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（Gibco）； opti-MEM（Gibco）；Lipofectamine 2000；胰酶（0.02%EDTA）；順鉑、阿霉素和依托泊苷購(gòu)自輝瑞公司；CCK8及凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；Trizol RNA試劑盒、RT試劑盒、Taq酶、PCR試劑盒均購(gòu)自Invitrogen公司，第1鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自大連寶生生物公司；鼠抗人單克隆抗體SPHK1購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗鼠IgG二抗購(gòu)自基因（上海）生物有限公司。

1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)；細(xì)胞培養(yǎng)箱；高速冷凍離心機(jī)；蛋白電泳儀；酶標(biāo)儀；熒光定量PCR儀（Eco）；FAC-Sort型流式細(xì)胞儀（Becton Dicksongon公司）。

1.4 細(xì)胞系 人SCLC敏感細(xì)胞株（H69）及對(duì)阿霉素耐藥的細(xì)胞株（H69AR）均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 應(yīng)用RPMI-1640培養(yǎng)基做細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，H69細(xì)胞株培養(yǎng)基含15%胎牛血清，H69AR細(xì)胞株培養(yǎng)基含20%胎牛血清。培養(yǎng)條件： 在37oC、 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析SPHK1的mRNA表達(dá) 用Trizol RNA試劑盒提取H69、H69AR細(xì)胞株中總RNA，操作按照說明書進(jìn)行；測(cè)量總RNA濃度，取1 μg RNA按逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說明合成cDNA，然后以該cDNA為模板，PCR儀中擴(kuò)增提取SCLC細(xì)胞中的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green染料法行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。SPHK1及內(nèi)參照GAPDH的引物序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR擴(kuò)增參照試劑盒說明進(jìn)行，以SPHK1基因的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行；反應(yīng)條件：95oC 30 s，（95oC 5 s, 60oC 30 s）*40 cycles，4oC。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，進(jìn)行PCR定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?；虻谋磉_(dá)量F=2-ΔΔCt，三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析?！鳌鱟t=（待測(cè)樣品的目的基因的Ct的平均值-待測(cè)樣本的看家基因的Ct的平均值）-（對(duì)照樣品的目的基因的Ct的平均值-對(duì)照樣本的看家基因的Ct的平均值）。

表1 SPHK1及內(nèi)參照GAPDH的引物序例Tab 1 Primer sequence of SPHK1 and GAPDH

1.5.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染H69AR細(xì)胞 將合成的靶向作用于SPHK1的SiRNA（RNAi#1：GGCTGAAATCCCTTCACG ； RNAi#2 ：GGGCAAGGCCTTGCAGCTC）寡核苷酸序列及陰性對(duì)照序列（NC），轉(zhuǎn)染入H69AR細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天，將適當(dāng)細(xì)胞濃度的H69AR細(xì)胞懸液接種于六孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)60%左右。將siRNA-lipofectamine 2000混合液（500 μL/孔）加入含有細(xì)胞及1.5 mL/孔Opti-MEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)板中，輕輕搖晃，使之混合。細(xì)胞板置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h-6 h后換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h檢測(cè)基因表達(dá)的變化，48 h后檢測(cè)蛋白的表達(dá)。

1.5.4 Western blot分析SPHK1蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白（凱基全蛋白提取試劑盒），BCA法蛋白定量。制備電泳凝膠，每孔中加樣50 μg蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5 g脫脂奶粉/100 mL TBST的封閉液中室溫封閉2 h。TBST漂洗3次，每次5 min，加入鼠抗人SPHK1單克隆（1：200）孵育，4oC過夜。TBST漂洗3次，每次5 min，用 HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG（1：5,000）孵育，37oC，45 min。TBST漂洗3次，每次5 min。加入顯色液，暗室曝光10 s-10 min，顯影。

1.5.5 CCK8法檢測(cè)藥物敏感性 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)空白對(duì)照孔。培養(yǎng)24 h后，將化療藥物加入培養(yǎng)基中并進(jìn)行倍比稀釋，按不同濃度分別加入指定的孔中，并設(shè)不加藥物的陽(yáng)性對(duì)照孔，每個(gè)藥物濃度、空白對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞在含藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，加入CCK8反應(yīng)液，在37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h-4 h后在酶標(biāo)儀上測(cè)450 nm吸光度。測(cè)得的（每個(gè)藥物濃度的OD值的平均值-空白孔平均值）/不含藥物的陽(yáng)性對(duì)照組平均值即為每個(gè)藥物濃度下細(xì)胞的存活率。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，根據(jù)各個(gè)藥物濃度細(xì)胞存活率，作對(duì)數(shù)曲線。

1.5.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以4×105/孔接種于6孔板中；37oC培養(yǎng)48 h；收集細(xì)胞，PBS洗滌2次；細(xì)胞重懸于100 μL含Annexin V-FITC和 0.5 μg PI的結(jié)合緩沖液（10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2）中；光室溫孵育15 min；加入400 μL結(jié)合緩沖液；流式細(xì)胞儀分析。

1.5.7 細(xì)胞周期檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化細(xì)胞，PBS洗2次，用75%乙醇冰浴固定24 h，然后用含1%BSA的PBS充分混勻洗滌2次，PI染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀測(cè)定并用Cell Quest軟件分析各組細(xì)胞群體在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的分布比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)或One-way ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以Mean±SD表示。SPHK1的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用Chi-Square檢驗(yàn)，生存分析用Kaplan-Meier法，所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPHK1在臨床組織標(biāo)本中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)SPHK1在76例SCLC組織標(biāo)本及癌旁組織中的表達(dá)，其中男性35例，女性41例；患者年齡30歲-75歲，中位年齡50歲，50歲以下患者41例，50歲及以上患者35例；局限期患者34例，廣泛期42例。對(duì)化療敏感者28例，對(duì)化療耐藥者48例，結(jié)果提示與癌旁組織比較（圖1A），SPHK1在SCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞胞漿和胞膜（圖1B），在SCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率為69.74%（53/76），在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為8.70%（4/46），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 SPHK1在SCLC組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 SPHK1在男性患者中的陽(yáng)性表達(dá)率為74.29%（26/35），在女性患者中的陽(yáng)性表達(dá)率為65.85%（27/41），兩者的SPHK1陽(yáng)性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.636, P=0.425）。SPHK1在不超過50歲的患者中陽(yáng)性表達(dá)率為70.73%（29/41），在50歲以上患者中陽(yáng)性表達(dá)率為68.57%（24/35），兩者的SPHK1陽(yáng)性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.042, P=0.838）。SPHK1在局限期（LD）患者中的陽(yáng)性表達(dá)率為52.94%（18/34），在廣泛期（ED）患者中的陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%（35/42），兩者的SPHK1陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.224, P=0.004）。SPHK1在化療敏感患者中的陽(yáng)性表達(dá)率為46.43%（13/28），在化療耐藥患者中的陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%（40/48），兩者的SPHK1陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.412, P=0.001)。SPHK1在存活患者中的陽(yáng)性表達(dá)率為47.06%（16/34），在死亡患者中的陽(yáng)性表達(dá)率為88.10%（37/42），兩者的SPHK1陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.993, P＜0.001）（表2）。

2.3 SPHK1在SCLC細(xì)胞株及血液標(biāo)本中的表達(dá) 如圖2A所示，QRT-PCR結(jié)果顯示H69AR細(xì)胞株中SPHK1的mRNA表達(dá)較H69細(xì)胞明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。Western blot結(jié)果也顯示在耐藥株H69AR中的SPHK1蛋白的表達(dá)較敏感株H69升高（P=0.007）（圖2B）；QRT-PCR結(jié)果提示化療耐藥患者血液標(biāo)本中SPHK1的表達(dá)明顯高于化療敏感的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖2C）。

2.4 下調(diào)SPHK1的表達(dá)后細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化 通過SiRNA下調(diào)H69AR細(xì)胞株中SPHK1的表達(dá)，通過QRT-PCR檢測(cè)Si-SPHK1的干擾效率，如圖3A所示，H69AR細(xì)胞轉(zhuǎn)染SPHK1的小干擾RNA后，與空白對(duì)照H69AR及陰性對(duì)照H69AR-NC比較，H69AR-Si-SPHK1細(xì)胞中SPHK1的表達(dá)下降76.3%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。CCK8檢測(cè)化療藥物敏感性的變化，結(jié)果提示下調(diào)SPHK1的表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)化療藥物DDP，ADM及VP-16的敏感性明顯增加，細(xì)胞的存活率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖3B-圖3D）。

2.5 下調(diào)SPHK1的表達(dá)后細(xì)胞周期和凋亡的變化 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，下調(diào)H69AR細(xì)胞中SPHK1的表達(dá)后，H69AR-Si-SPHK1組細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞較H69AR組及H69AR-Si-NC組明顯增多，S期細(xì)胞明顯減少。結(jié)果提示下調(diào)SPHK1使細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1期阻滯（圖4A，P＜0.001）。通過SiRNA技術(shù)下調(diào)H69AR細(xì)胞中SPHK1的表達(dá)后H69AR-Si-SPHK1組細(xì)胞的凋亡率為（24.32%±0.406%）明顯高于空白對(duì)照H69AR（5.14%±0.067,2%）及陰性對(duì)照H69AR-NC（6.07%±0.087,6%）組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B，P＜0.01），提示下調(diào)SPHK1的表達(dá)能明顯促進(jìn)了H69AR細(xì)胞的凋亡。

表2 SPHK1的陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系Tab 2 Association of SPHK1 with clinical parameters

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SPHK1在 SCLC癌旁組織（A）及癌組織中（B）的表達(dá)（×400）Fig 1 The expression of SPHK1 was presented in the para-carcinoma tissues (A)and carcinoma tissues (B) (×400)

圖2 QRT-PCR和Western blot在mRNA水平（A）和蛋白水平（B）檢測(cè)H69及H69AR細(xì)胞中SPHK1的表達(dá)；C：化療耐藥患者與化療敏感的患者血液標(biāo)本中SPHK1的差異表達(dá)，**與H69組比較，P＜0.01。Fig 2 The expression of SPHK1 mRNA (A) and protein (B) were detected in H69 and H69AR by QRT-PCR and Western blot； C: The differential expression of SPHK1 in chemosensitivity and drug resistance patients. **compare with H69, P＜0.01.

2.6 SCLC患者生存及預(yù)后分析 采用Kaplan-Meier法估計(jì)患者生存時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的生存時(shí)間與性別和年齡無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；疾病的分期，患者對(duì)化療的敏感性及SPHK1的表達(dá)與患者的生存時(shí)間相關(guān)。局限期患者的生存時(shí)間長(zhǎng)于廣泛期患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.796，P=0.005，圖5A）；對(duì)化療敏感者的生存時(shí)間長(zhǎng)于耐藥患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.985，P=0.003，圖5B）；SPHK1低表達(dá)患者的生存時(shí)間長(zhǎng)于高表達(dá)患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=27.385，P＜0.001，圖5C）。

Cox回歸分析患者的性別、年齡、疾病分期、化療敏感性及SPHK1的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)疾病分期和SPHK1可作為獨(dú)立的預(yù)后因子，分期越晚的相對(duì)危險(xiǎn)度2.261，95%相對(duì)危險(xiǎn)度的可信區(qū)間為（1.225-4.172），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（W=6.813,P=0.009）；SPHK1高表達(dá)的相對(duì)危險(xiǎn)度為5.431，95%相對(duì)危險(xiǎn)度的可信區(qū)間為（2.484-11.875），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（W=17.976, P＜0.001）（表3）。

3 討論

肺癌是當(dāng)今世界對(duì)人類健康危害最大的惡性腫瘤之一，我國(guó)肺癌發(fā)病率增長(zhǎng)迅速，多數(shù)學(xué)者把更多的研究目光集中在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）治療上，而SCLC的發(fā)病率卻悄然增長(zhǎng)，由于研究的關(guān)注度和力度明顯不及前者，多年來治療無明顯突破[8,9]。SCLC的治療以全身化療為主，聯(lián)合放療和手術(shù)為主要治療手段。目前臨床上化療一般采取順鉑為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合治療方案，盡管SCLC患者對(duì)化療敏感，但很快出現(xiàn)的MDR而導(dǎo)致化療失敗[10]。因此，如何克服SCLC的耐藥性，成為臨床上治療SCLC及提高患者生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存時(shí)間急需解決的重要問題。SCLC的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，常有多種因素參與其中，現(xiàn)己認(rèn)識(shí)到的耐藥機(jī)制包括：①具有外排泵作用的膜蛋如ABC家族成員P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）、肺耐藥蛋白（lungresistance-related protein, LRP）等過度表達(dá)；②細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)異常，如拓?fù)洚悩?gòu)酶、谷胺酞轉(zhuǎn)膚酶等；③細(xì)胞抗凋亡作用增強(qiáng)，如抗凋亡基因Bcl-2、cmyc等過度

表達(dá)；④細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)增強(qiáng)。這些途徑中的關(guān)鍵基因在遺傳學(xué)水平及表觀遺傳水平的改變均可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞形成耐藥表型[11]。

表3 Cox回歸分析疾病的分期、SPHK1的表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系Tab 3 Cox regression analysis on relationship between disease stage, expression levels of SPHK1 and prognostic of NSCLC patients

圖3 下調(diào)SPHK1的表達(dá)后細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化。A：細(xì)胞轉(zhuǎn)染SPHK1的SiRNA后，在mRNA水平檢測(cè)其干擾效率。H69AR為空白對(duì)照；H69AR-NC為陰性對(duì)照；H69AR-Si-SPHK1為轉(zhuǎn)染SPHK1下調(diào)H69AR細(xì)胞中SPHK1的表達(dá)；CCK8檢測(cè)下調(diào)H69AR中SPHK1的表達(dá)后,細(xì)胞對(duì)化療藥物ADM （B），DDP（C）及VP-16（D）的敏感性的變化。**與H69AR及H69AR-NC組比較，P＜0.01. DDP：順鉑；ADM：阿霉素；VP-16：依托泊苷。Fig 3 The sensitivities of cells to chemotherapy drugs were measured after H69AR cells transfected with Si-SPHK1. A: Expression of SPHK1 after transfection of SPHK1 siRNA in H69AR cells. The sensitivities of cells to chemotherapy drugs ADM (B), DDP (C) and VP-16 (D) were measured after H69AR cells transfected with Si-SPHK1 or mock by CCK-8 assay. **compare with H69AR and H69AR-NC, P＜0.01. DDP: Cis-platinum； ADM:Adriamycin； VP-16: Etoposide.

SPHK1為S1P產(chǎn)生的限速酶，S1P在脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用，可間接的調(diào)控S1P的功能，如抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)粘附相關(guān)分子的表達(dá)、刺激細(xì)胞的增殖效應(yīng)等[12]。在生物體內(nèi)一些受體酪氨酸激酶以及多種生物活性劑都可激活SPHK1的表達(dá)，而被激活的SPHK1在生理?xiàng)l件下可以刺激細(xì)胞的增生，但SPHK1活性的異常激活將可能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增生及腫瘤的發(fā)生[13]。Tan等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，SPHK1作為結(jié)腸癌獨(dú)立預(yù)后因子，促進(jìn)結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展。Meng等[15]通過QRT-PCR和免疫組化法檢測(cè)膀胱癌組織和癌旁組織中SPHK1的差異表達(dá)，結(jié)果提示SPHK1在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，SPHK1的表達(dá)于膀胱癌的組織學(xué)分級(jí)和臨床分期相關(guān)，高表達(dá)SPHK1的5年生存率明顯降低，SPHK1作為獨(dú)立的預(yù)測(cè)膀胱癌預(yù)后差的指標(biāo)。Malavaud[16]認(rèn)為SPHK1過度激活所呈現(xiàn)的惡性表現(xiàn)可能是由于SPHK1的磷酸化以及由其引起的SPHK1的蛋白異位引起。SPHK1不僅在人多種惡性腫瘤中過表達(dá)，同時(shí)其參與到了腫瘤血管的形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡以及在腫瘤細(xì)胞藥物耐藥中發(fā)揮重要的作用。血管的再生在實(shí)體瘤發(fā)展中占有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)S1P能夠直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)血管形成，且其誘導(dǎo)能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)比VEGF有效，同時(shí)還能增加人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的VEGF mRNA的表達(dá)，與VEGF發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤血管的生成[17]。新近的研究[18]發(fā)現(xiàn)，SPHK1的過表達(dá)不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，同時(shí)SPHK1的高表達(dá)還能增加細(xì)胞由G0/G1期阻滯。Rosa等[19]通過檢測(cè)直腸癌患者體內(nèi)的SPHK1 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在先天性或獲得性對(duì)西妥昔單抗耐藥的患者中SPHK1的表達(dá)是增高或者活化的。我們?cè)谇捌趯?duì)SCLC耐藥細(xì)胞株和敏感細(xì)胞株高通量芯片篩選中發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞株中SPHK1的表達(dá)明顯增高，為了進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果我們進(jìn)一步從基因和蛋白水平檢測(cè)了SCLC中SPHK1的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)了對(duì)化療敏感和耐藥患者血液標(biāo)本中SPHK1的差異表達(dá)，結(jié)果與芯片一致。隨后通過SiRNA下調(diào)SPHK1的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性明顯增加，下調(diào)SPHK1的表達(dá)后細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1期阻滯，SPHK1的表達(dá)與患者的性別、年齡無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與患者對(duì)化療藥物的敏感性、疾病分期及生存期密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究為SCLC的耐藥機(jī)制的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)和未來的研究方向。但MDR的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，多種潛在的上下游轉(zhuǎn)錄因子均可對(duì)SPHK1發(fā)揮調(diào)控作用，其中有癌基因，也有抑癌基因。因此SPHK1在SCLC耐藥中的具體作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究加以闡明。

圖4 下調(diào)SPHK1的表達(dá)后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期（A）和凋亡（B）的變化Fig 4 The cell cycle (A) and apoptosis rate (B) was detected by flow cytometric analysis after transfected with Si-SPHK1

圖5 Kaplan-Meier法估計(jì)疾病分期（A）、化療敏感性（B）及SPHK1的表達(dá)（C）與患者生存時(shí)間的關(guān)系。LD：局限期；ED：廣泛期。Fig 5 The relationship of survival time with disease stage (A), chemosensitivity (B) and expression of SPHK1 (C) by Kaplan-Meier assay. LD:Limited disease； ED: Extensive-stage disease.