植 爽，胡 艷，曹 婧，肖小君,2*，陳文年,2

(1.內(nèi)江師范學院生命科學學院，四川 內(nèi)江 641112；2.四川省高等學校特色農(nóng)業(yè)資源研究與利用重點實驗室，四川 內(nèi)江 641112)

珍稀瀕危植物珙桐初代培養(yǎng)研究

植 爽1，胡 艷1，曹 婧1，肖小君1,2*，陳文年1,2

(1.內(nèi)江師范學院生命科學學院，四川 內(nèi)江 641112；2.四川省高等學校特色農(nóng)業(yè)資源研究與利用重點實驗室，四川 內(nèi)江 641112)

以珙桐芽體為試材，采用WPM、1/2 MS、B5三種基本培養(yǎng)基，附加6-BA、NAA、GA34因素3水平正交實驗設計，同時研究了不同外植體消毒時間、剝離方式、芽體長度對珙桐初代培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：用75%酒精30 s+0.1% HgCl220 min消毒效果較好，外植體長度大于0.5 cm，剝離芽體至剩余鱗片葉1～2個的處理方式有利于降低污染率，最佳芽誘導的培養(yǎng)基配方為：WPM+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L + AC 0.5 g/L。

珙桐；誘導；外植體；初代培養(yǎng)

珙桐(DavidainvolucrataBaill.)，又名鴿子樹，為我國特有的珍稀孑遺植物，被列為國家Ⅰ級瀕危保護植物，具有極高的觀賞價值和研究價值[1]。然而，珙桐的種子殼厚而堅硬，有后熟現(xiàn)象，休眠期長，發(fā)芽率低，繁殖和引種困難，所以至今未成為廣泛應用的園林綠化樹種[2]。近年來由于人類活動對自然環(huán)境的影響，珙桐的生態(tài)環(huán)境遭到了嚴重破壞，導致其個體數(shù)量逐漸減少，分布范圍也日益縮小，因此挽救和保護珙桐并擴大其數(shù)量迫在眉睫。采用組織培養(yǎng)技術(shù)進行珙桐再生體系的建立可為保護珙桐種質(zhì)資源提供一條新途徑，目前關(guān)于這方面的研究主要集中在愈傷組織的誘導[3-5]，種胚離體培養(yǎng)[6-8]，帶芽莖段[9-10]或冬芽[11]誘導叢生芽增殖，總的來說有關(guān)珙桐植株再生的文獻報道較少，且進展緩慢，初代培養(yǎng)的重復性差。為此，本試驗對外植體不同消毒時間、剝離方式、芽體長度、激素配比和基本培養(yǎng)基的篩選等方面做了系統(tǒng)研究，有效降低了外植體的污染率，為珙桐高效離體再生體系的建立提供初代培養(yǎng)的理論依據(jù)，以期最終為珙桐的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2013年7月，在四川省宜賓市珙縣選取當年生枝條上未萌發(fā)的芽體作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 基本培養(yǎng)基及激素質(zhì)量濃度的篩選 本試驗采用L9(34)正交試驗設計(見表1)，基本培養(yǎng)基為WPM、1/2 MS、B5，附加細胞分裂素6-BA 3水平分別為1.0，2.0，3.0 mg/L，生長素NAA 3水平分別為0.05，0.1，0.2 mg/L，赤霉素GA33水平分別為0，2.0，5.0 mg/L。其中含蔗糖30 g/L，瓊脂粉4.6 g/L，活性炭0.5 g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.8～6.0，高壓滅菌20 min( 121 ℃) 后備用。

將珙桐芽放在洗衣粉溶液中浸泡2 min，用干凈的白紗布輕輕將芽鱗擦干凈，再在流水下沖洗2 h后在超凈工作臺上先用75%的酒精溶液浸泡20 s，經(jīng)無菌水沖洗3次，再用0.1%HgCl2溶液浸泡15 min，經(jīng)無菌水沖洗5～6次。用滅菌濾紙吸干外植體表面水分，剝?nèi)ト垦亏[片，留絨狀未展開葉2～3片，去除與莖連接處的木質(zhì)部接入培養(yǎng)基，選取芽誘導率最高的培養(yǎng)基配方用于以下試驗。

1.2.2 外植體不同消毒時間、剝離方式及長度對珙桐芽體萌發(fā)的影響 在基本培養(yǎng)基及激素質(zhì)量濃度的篩選基礎上，設置外植體消毒時間分別為75%酒精30 s+0.1% HgCl2(10，20，30 min)；剝離方式分別為：①不剝芽鱗片，②剝?nèi)ゲ糠峙c消毒液接觸的芽鱗片，③將芽鱗片全部剝掉，剩絨狀葉2～3個；外植體長度分別為①d>1 cm，②0.5 cm

1.3 培養(yǎng)條件

將接種后的材料置于培養(yǎng)室內(nèi)，先暗處理2 d，此后每日光照14 h，光照度為2 000 lx，溫度控制在(25±2) ℃，以上每個處理均接種10管，重復3次。

1.4 統(tǒng)計分析

定期觀察外植體污染、褐化、萌發(fā)及芽的生長情況并記錄數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基及激素質(zhì)量濃度對珙桐芽誘導的影響

從結(jié)果(見表1)可以看出，基本培養(yǎng)基及激素質(zhì)量濃度對珙桐芽誘導有明顯影響。WPM與1/2 MS明顯優(yōu)于B5培養(yǎng)基，低質(zhì)量濃度的6-BA及 NAA效果好于高質(zhì)量濃度，GA3質(zhì)量濃度越高芽體啟動越早，生長速度越快，鄒利娟等[11]研究表明在培養(yǎng)中適當添加GA3能促進芽苗生長，葉片擴大，縮短培養(yǎng)時間。但本試驗研究發(fā)現(xiàn)GA3對芽體長勢影響較大，在GA3的作用下，隨著培養(yǎng)時間延長，芽的生長更容易發(fā)生畸形化，且質(zhì)量濃度越高，畸形化程度越嚴重，出現(xiàn)披針形葉，葉片顏色出現(xiàn)紅色或紫紅色。觀察發(fā)現(xiàn)30 d后未添加GA3的培養(yǎng)基中新生葉片廣卵圓形，綠色，完全展開且長勢旺盛。直觀分析結(jié)果表明：4種因素的極差(R值)大小依次是C>A>B>D，因此4種因素對珙桐芽體萌發(fā)的影響大小依次是NAA>基本培養(yǎng)基>6-BA>GA3，從均值(K)可以看出，使用WPM培養(yǎng)基配合低質(zhì)量濃度的6-BA及 NAA有利于珙桐的芽誘導，即最佳配方為WPM+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L+AC 0.5 g/L。

表1 珙桐芽誘導正交試驗結(jié)果及直觀分析

“+”表示葉片完全卷曲;“++” 表示葉片較為卷曲;“+++”表示葉片完全舒展開。

2.2 外植體不同消毒時間對珙桐芽體萌發(fā)的影響

從結(jié)果(見表2)可知，用75%酒精與0.1%HgCl2的不同消毒時間處理外植體的效果差異顯著，其中75%酒精30 s+0.1%HgCl210 min的污染率最高達96.67%，且芽一直未萌發(fā)，隨著HgCl2溶液浸泡時間的加長，污染率有所降低，但處理30 min外植體受消毒劑毒害作用加大，表現(xiàn)為芽生長速度緩慢且長勢差，而處理20 min的珙桐芽啟動早，20 d即可觀察到外植體開始長出新葉片，且葉片深綠色，長勢好，芽誘導率最高達76.92%。

表2 外植體不同消毒時間對珙桐芽體萌發(fā)的影響

同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同外植體剝離方式對珙桐芽體萌發(fā)的影響

從結(jié)果(見表3)可以看出，不同的剝離方式對珙桐芽的成功誘導有顯著影響。未經(jīng)任何處理的芽體幾乎全部污染，剩余鱗片1～2個與剩絨葉狀1～2個剝離方式的污染率和誘導率均存在顯著差異，觀察發(fā)現(xiàn)后者芽啟動早，10 d后即長出新葉片，生長情況良好，但污染率較前者高出36.67%。綜合試驗結(jié)果，分析認為剩余鱗片1～2個的剝離方式有利于珙桐芽體萌發(fā)，25 d左右可見新葉片長出，且污染率最低，誘導率高達78.26%。

2.4 不同外植體長度對珙桐芽體萌發(fā)的影響

從結(jié)果(見表4)可以看出，外植體長度d<0.5 cm時，珙桐的芽誘導率為0，且污染率高達90%，分析認為由于外植體太小，剝離比較困難，在空氣中操作時間較長，從而引起污染，且芽體太小不易成活。當d>0.5 cm時，污染率顯著降低，誘導率最高達75%，外植體越大，新葉片展開速度越快，芽體長勢好，啟動快。

表3 不同外植體剝離方式對珙桐芽體萌發(fā)的影響

同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表4 不同外植體大小對珙桐芽體萌發(fā)的影響

同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

3.1 外植體的選擇及處理方式對珙桐芽誘導的影響

珙桐為多年生木本植物，母株帶菌多，污染嚴重，取材困難，外植體的遺傳和生理差異使初次培養(yǎng)的可重復性降低，初次培養(yǎng)的嚴重污染及酚類物質(zhì)的氧化使培養(yǎng)難以進行[12]。在組織培養(yǎng)中，外植體的選擇及處理是組織培養(yǎng)能否成功的第1步[13]。綜合本試驗研究結(jié)果認為，用75%酒精30 s+0.1%HgCl2處理20 min消毒效果較好，常規(guī)滅菌劑在材料表面消毒的同時對植物組織往往亦有傷害，0.1%HgCl2處理30 min后對珙桐污染率可以有效控制，但誘導率顯著下降，且芽體受傷害嚴重，表現(xiàn)為啟動慢，死亡率高，而處理10 min的污染率較高，未達到消毒效果。選取外植體長度大于0.5 cm且剝離芽體至剩余鱗片葉1～2個的處理方式有利于控制污染，這可能是因為外植體較大，在剝離與消毒劑接觸的芽鱗片時操作較容易，技術(shù)更熟練，減少了外植體在空氣中的暴露機會，從而降低了污染率。

3.2 基本培養(yǎng)基及激素質(zhì)量濃度對珙桐芽誘導的影響

在植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中的鹽濃度對外植體褐變和試管苗玻璃化均有一定影響[14]。本試驗研究認為，珙桐的初代培養(yǎng)中選用WPM和1/2MS培養(yǎng)基效果較好，這與大多數(shù)學者的研究結(jié)果一致[4,15]，符合多數(shù)木本植物在誘導階段采用較低無機鹽濃度的結(jié)論。而B5培養(yǎng)基由于含有高濃度的硝態(tài)氮和低濃度的鈣鹽，可能會抑制珙桐的芽誘導。

植物激素的種類、質(zhì)量濃度和配比對組織培養(yǎng)的器官形成起著重要的作用。本試驗研究表明，各種激素的影響力大小依次為NAA>6-BA>GA3，這可能由于本試驗采取材料的時間為夏季，珙桐芽體未進入休眠狀態(tài)，用低質(zhì)量濃度的生長素NAA和細胞分裂素6-BA即可促進芽體萌發(fā)生長，同時觀察發(fā)現(xiàn)GA3能促進芽體提早啟動并伸長生長，但隨著質(zhì)量濃度的增加，畸形化形象嚴重，變異增多，這可能與激素物質(zhì)抑制過氧化氫酶和過氧化物酶的活性或抑制糖酵解過程有關(guān)[16]。因此，在珙桐的初代培養(yǎng)過程中，GA3的最佳促進芽萌發(fā)質(zhì)量濃度還需進一步研究。綜合試驗結(jié)果認為WPM+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L+AC 0.5 g/L，為珙桐組織培養(yǎng)芽誘導最佳培養(yǎng)基。

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InitialculturestudyofendangeredplantDavidiainvolucrataBaill.invitromicropropagation

ZHI Shuang1, HU Yan1, CAO Jing1, XIAO Xiao-jun1,2*, CHEN Wen-nian1,2

(1.School of Life Sciences, Neijiang Normal University, Neijiang 641112,China; 2.Key Laboratory of Colleges and Universities in Sichuan for Research and Utilization of Distinctive Agricultural Undertakings, Neijiang 641112,China)

Using basal medium of WPM,1/2MS and B5 which added 6-BA,NAA and GA3, the time of different explant disinfection, the way of stripping and the length of buds ofDavidiainvolucratawere studied.The results showed that the disinfection effect was appropriate by adopting 75% alcohol for 30 and 0.1% HgCl2for 20 min, it was good for reducing pollution to us the explants which were more than 0.5 cm and the stripping way to the rest 1 to 2 scale leaves.And the best medium for buds induction was WPM+ 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L + AC 0.5 g/L.

DavidiainvolucrataBaill.;Induction;Explant; Initial culture

1001-7380(2014)04-0029-04

2014-05-03

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310640010)；內(nèi)江師范學院校級重點項目(12NJZ04)；內(nèi)江市科技支撐計劃項目(12109)；內(nèi)江師范學院大學生科研項目(13NSD-76)

植 爽(1992-)，女，四川都江堰人，大學本科畢業(yè)，研究方向：植物組織培養(yǎng)。

*通信作者：肖小君(1982- )，女，四川岳池人，助理研究員，碩士，研究方向：植物組織培養(yǎng)及生理生化。

S792.99；Q943.1

A

10.3969/j.issn.1001-7380.2014.04.007