蔡新衛(wèi) 黃 新 祝 斐 路 遙 楊 勇

(1 瑞昌市中醫(yī)院神經(jīng)外科 江西瑞昌 332200；

2 解放軍171醫(yī)院神經(jīng)外科 江西九江 332000)

Beclin 1蛋白在星形細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)及意義

蔡新衛(wèi)1黃 新2祝 斐2路 遙2楊 勇2

(1 瑞昌市中醫(yī)院神經(jīng)外科 江西瑞昌 332200；

2 解放軍171醫(yī)院神經(jīng)外科 江西九江 332000)

目的檢測(cè)自噬相關(guān)基因Beclin 1在星形細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)情況，探討其與星形細(xì)胞腫瘤病理和臨床分級(jí)的相關(guān)性及意義。方法用免疫組化檢測(cè)52例不同級(jí)別的星形細(xì)胞腫瘤Beclin 1蛋白表達(dá)，并結(jié)合臨床和病理因素進(jìn)行分析。結(jié)果免疫組化顯示Beclin 1蛋白星形細(xì)胞腫瘤中表達(dá)強(qiáng)弱隨腫瘤級(jí)別升高而降低。結(jié)論Beclin 1在高級(jí)別星形細(xì)胞腫瘤中表達(dá)下降，檢測(cè)Beclin 1的表達(dá)可作為判斷星形細(xì)胞瘤惡性程度輔助指標(biāo)。

星形細(xì)胞腫瘤，自噬，Beclin 1

Beclin 1被認(rèn)為是自噬相關(guān)的腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤表達(dá)減少，并且其表達(dá)水平與一些腫瘤的病理分級(jí)、臨床分期、預(yù)后相關(guān)[1-2]。筆者應(yīng)用免疫組織化對(duì)星形細(xì)胞腫瘤中Beclin 1的表達(dá)進(jìn)行定性，分析其與腫瘤病理分級(jí)的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選擇九江解放軍171醫(yī)院和上海長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)外科2009年10月—2012年10月住院手術(shù)治療的初發(fā)星形細(xì)胞腫瘤病例共52例(其中，男32例，女20例，年齡24～68歲, 平均年齡44歲，所有研究對(duì)象術(shù)前未接受任何輔助治療)。手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，組織切片厚度4 μm。

根據(jù)2003年WHO有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類方法，對(duì)腫瘤進(jìn)行分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)(毛細(xì)胞性星形細(xì)胞瘤)5例，Ⅱ級(jí)(星形細(xì)胞瘤)20例，Ⅲ級(jí)(間變性星形細(xì)胞瘤)8例，Ⅳ級(jí)(膠母細(xì)胞瘤)19例。

1.2 方法

1.2.1 試劑 Beclin 1兔抗多克隆抗體(購(gòu)自Santa Cruz公司)。過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素試劑盒和DAB試劑盒(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶( SP) 法。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，以胰酶進(jìn)行抗原修復(fù)，依次滴加過氧化物酶阻斷液( 37℃ 封閉10 min) 、10%非免疫性動(dòng)物血清( 37℃ 孵育40 min) 、第一抗體( 稀釋度為1∶100，4℃ 過夜) 、生物素標(biāo)記的第二抗體(37℃ 孵育20min)、S-A/HRP溶液( 37℃ 孵育20 min)，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

根據(jù)膠質(zhì)瘤WHO病理分型標(biāo)準(zhǔn)，將Ⅰ、Ⅱ級(jí)歸為低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級(jí)歸為高級(jí)別膠質(zhì)瘤進(jìn)行分析。用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：等級(jí)相關(guān)分析采用Kruskal-wallis H非參數(shù)檢驗(yàn)。以p<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)果判斷

所有切片采用盲法由兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比率和染色深度分別進(jìn)行評(píng)估，最后綜合評(píng)定。

(1)陽(yáng)性細(xì)胞的比率評(píng)分：0 分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)<10%，1分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)10～25%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)26～50%，3 分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)>50%。

(2)染色深度評(píng)分： 0分為無染色，1分為淡黃色，3分為黃色至棕黃色，2分為染色強(qiáng)度介于1分與3分之間。

(3)總積分=陽(yáng)性細(xì)胞比率評(píng)分+染色強(qiáng)度評(píng)分：0 分為陰性(-)， 1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為陽(yáng)性( ++)，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性( +++)。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

Beclin 1陽(yáng)性表達(dá)主要見于細(xì)胞漿(見圖1)，細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞核中亦有表達(dá)。I～I(xiàn)V級(jí)星形細(xì)胞腫瘤Beclin 1表達(dá)強(qiáng)弱隨腫瘤級(jí)別升高而降低(見表1)，Beclin1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.006)。

圖1 Beclin 1在星形細(xì)胞腫瘤中的免疫組化染色 星形細(xì)胞瘤I級(jí)(a,b,c)，星形細(xì)胞瘤II級(jí)(d,e)，星形細(xì)胞瘤III級(jí)(g)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (f,h,i)中陽(yáng)性表達(dá)，×200倍。

表1 beclin-1 在不同級(jí)別的星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)

2.3 免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

Beclin 1免疫印跡檢測(cè)在不同性別、年齡、術(shù)前KPS評(píng)分之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在病理分級(jí)和生存期之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

Beclin 1是自噬通路上的重要調(diào)節(jié)因子，主要通過與ClassⅢ/PI3K形成復(fù)合物促進(jìn)自噬體的形成[3]，是第一個(gè)被確認(rèn)的與自噬相關(guān)的腫瘤抑制因子[4]。Beclin 1缺失或表達(dá)下降是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的原因之一[5]。Beclin 1等位基因缺失或突變發(fā)生在75 %的卵巢癌[6]、50 %的乳腺癌[7]和40 %的前列腺癌[8]中，其表達(dá)量有不同程度的下降。臨床病理學(xué)研究應(yīng)用免疫組化的方法，已經(jīng)檢測(cè)出Beclin 1蛋白在多種惡性腫瘤中表達(dá)減少，其中包括肺癌[9]、食道鱗狀細(xì)胞癌[2]、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及其他中樞神經(jīng)惡性腫瘤[10]。本研究對(duì)人腦不同級(jí)別的星形細(xì)胞腫瘤標(biāo)本中Beclin 1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Benclin 1在低級(jí)別腫瘤中的表達(dá)高于高級(jí)別腫瘤。Beclin 1抑制腫瘤的作用可能是通過提高腫瘤細(xì)胞自噬活性。通過研究Beclin 1基因敲除小鼠的胚胎干細(xì)胞，Yue等[11]發(fā)現(xiàn)Beclin 1- /-小鼠死于胚胎早期，Beclin 1+ /-小鼠雖然表型正常，但體內(nèi)細(xì)胞自噬活性降低，而且自發(fā)腫瘤發(fā)生率高。將Beclin 1轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞株后，Liang等[12]發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞自噬空泡的數(shù)量增加，外增殖能力及惡性表型下降，并且在裸鼠體內(nèi)腫瘤形成能力降低。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)某些化療藥物能引發(fā)細(xì)胞自噬性死亡，而在凋亡抑制細(xì)胞中上調(diào)beclin 1表達(dá)提高自噬活性，具有治療作用[13]。Beclin 1抑制腫瘤的機(jī)制不僅包括誘發(fā)細(xì)胞自噬性死亡，還能停滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤壞死及炎癥擴(kuò)散，預(yù)防基因組突變[14]。一些腫瘤相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通道與Beclin 1基因關(guān)系密切，如：PTEN通道[15]和Rb信號(hào)傳導(dǎo)通道[16]都與Beclin 1不同程度相關(guān)。

另有研究發(fā)現(xiàn)Beclin 1表達(dá)與多種腫瘤惡性程度呈負(fù)相關(guān)。33%的食道癌Beclin 1表達(dá)缺失，Beclin 1表達(dá)與組織侵潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期明顯相關(guān)；并且beclin 1表達(dá)陽(yáng)性組患者生存率高于陰性組[2]。卵巢腫瘤中，Beclin 1在良性腫瘤的陽(yáng)性率(100%)和交界性卵巢腫瘤的陽(yáng)性率(84%)都明顯高于上皮性卵巢癌(57%)；且Beclin 1表達(dá)與上皮性卵巢癌患者FIGO分期相關(guān)[1]?，F(xiàn)有的研究絕大多數(shù)顯示Beclin 1在惡性腫瘤中表達(dá)是下降的，但在胃癌和結(jié)腸癌中，Ahn等[17]發(fā)現(xiàn)Beclin 1表達(dá)增高。這不排除Beclin1對(duì)腫瘤抑制作用具有組織特異性的可能性[18]。本研究與Miracco等[10]的研究結(jié)果一致，均發(fā)現(xiàn)Beclin 1在高級(jí)別星形細(xì)胞瘤中表達(dá)低于低級(jí)別腫瘤。

Beclin 1是自噬通路上的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，該通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究還有待進(jìn)一步深入，目前利用Beclin 1研究自噬在腫瘤發(fā)病機(jī)制和化療中的作用已取得了一些進(jìn)展。星形細(xì)胞腫瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，筆者研究發(fā)現(xiàn)beclin 1在臨床腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)與腫瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，Beclin 1的測(cè)定有助于臨床對(duì)腫瘤惡性程度的判斷，也為探索星形細(xì)胞腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的思路。

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(責(zé)任編輯梁光霞)

2014-9-28

黃新，allahhuang@163.com

R 651.1

A

1674-9545(2014)04-0063-(04)