張四洋 李春艷 高建 邱雪杉 崔澤實

Ca2+是非常重要的細胞內(nèi)第二信使，參與肌細胞收縮、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、細胞分化和細胞凋亡等生理、病理過程。細胞內(nèi)生理Ca2+濃度為10 nM-100 nM，Ca2+超載時濃度為基礎(chǔ)濃度的10倍左右，與心臟疾病、神經(jīng)損傷、腫瘤發(fā)生等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。H2O2是常見的活性氧分子，向細胞外液加入H2O2，可以使細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，文獻[2]報道Ca2+介導(dǎo)了H2O2作用下的大鼠胰腺腺泡AR42J細胞的凋亡。肺癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，研究[3-5]表明，引起胞漿Ca2+濃度升高的刺激通過依賴線粒體途徑的caspases通路或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，誘導(dǎo)肺癌細胞發(fā)生凋亡。實時監(jiān)測肺癌細胞內(nèi)Ca2+濃度和胞漿內(nèi)Ca2+水平，有助于深入研究Ca2+介導(dǎo)肺癌細胞凋亡的分子機制，以尋找促進肺癌細胞凋亡的有效方法。

自1989年開始，應(yīng)用熒光染料fluo-3對細胞內(nèi)Ca2+成像，揭示了很多涉及Ca2+信號時空變化的細胞生物學(xué)功能。Fluo-3也結(jié)合流式細胞儀用于檢測Ca2+作為第二信使參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞藥理學(xué)篩選等實驗研究。Fluo-3用于監(jiān)測活細胞內(nèi)[Ca2+]i變化，其最主要的優(yōu)勢在于利用488 nm的氬離子激光源，可以在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察， fl uo-3與Ca2+結(jié)合后其熒光強度迅速增強。Fluo-4是 fl uo-3的衍生物，用F取代了 fl uo-3分子中的2個Cl。其激發(fā)波長較fluo-3更接近488 nm，產(chǎn)生更強、更穩(wěn)定的熒光信號，適合于多數(shù)配置氬離子激光器的激光掃描共聚焦顯微鏡觀察[6]，也可以用于流式細胞儀檢測，以及利用多功能酶標儀讀取熒光信號[7]。

本研究采用目前實驗室常用的Ca2+熒光探針fluo-3和fluo-4負載人肺癌A549細胞，觀察H2O2處理的A549細胞中[Ca2+]i變化，對fluo-3和fluo-4的熒光強度和[Ca2+]i測定值進行比較和分析，并探討在H2O2作用下細胞凋亡情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Fluo-3 AM（Biotium公司，純度95%）和fluo-4 AM（DOJINDO公司，純度98%），均用DMSO溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌，貯存液濃度為1 mM，-20oC避光保存。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品，激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿（35 mm）購自NEST公司，Ionomycin和細胞固定液均為碧云天公司產(chǎn)品，DAPI細胞凋亡染色試劑盒購自凱基公司，H2O2為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)肺癌細胞A549，0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有實驗均采用對數(shù)生長期細胞。

1.3 探針負載細胞并觀察[Ca2+]i變化 熒光探針f l uo-3 AM和fluo-4 AM負載細胞時用無Ca2+細胞外液（135 mM NaCl、2 mM KCl、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、4 g/L葡萄糖）稀釋成工作濃度5 μM。細胞傳代24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次，向細胞中加入fluo-3（5 μM）或fluo-4（5 μM）工作液，避光37oC孵育40 min。棄去熒光探針，更換新的無Ca2+細胞外液，避光37oC繼續(xù)孵育20 min，保證AM在細胞內(nèi)被充分水解。在FV1000型激光共聚焦顯微鏡（Olympus, Japan）下觀察選擇貼壁良好、形態(tài)伸展、熒光強度較亮的細胞，設(shè)置掃描條件為488 nm波長激發(fā)、39%激光強度、PMT（790）、Pinhole（310 μm）、同時采集DIC圖像，每5 s采集一幅，共采集40 min左右。首先掃描10幅待熒光強度曲線穩(wěn)定后，向細胞中加入不同濃度的H2O2（5 mM、10 mM或50 mM）；曲線穩(wěn)定后，向細胞中加入EGTA（4 mM）+ Ionomycin（5 μM）；曲線再一次穩(wěn)定后，向細胞中加入CaCl2（10 mM），曲線穩(wěn)定后中止實驗。鈣離子濃度計算公式為Kd(FFmin)/(Fmax-F)[8]，其中f l uo-3探針Kd=400 nM，f l uo-4探針Kd=360 nM。

1.4 DAPI染色檢測細胞凋亡 細胞經(jīng)H2O2處理30 min后，用細胞固定液4%多聚甲醛室溫固定10 min，加入DAPI染色液避光孵育20 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個200×鏡下視野，計算凋亡細胞百分比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，進行數(shù)據(jù)分析及處理。應(yīng)用t檢驗比較fluo-3和fluo-4平均熒光強度的差異，應(yīng)用χ2檢驗比較凋亡細胞百分比，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 H2O2刺激前，負載fluo-3或fluo-4的細胞熒光強度比較。66 mm×58 mm（300×300 DPI）。Fig1 The comparison of fluorescence intensity in cells loaded with fluo-3 or fluo-4 before H2O2 stimulation. 66 mm×58 mm (300×300 DPI).

2 結(jié)果

2.1 未經(jīng)H2O2刺激前細胞中fluo-3和fluo-4染色結(jié)果比較在相同的細胞負載和圖像采集條件下，未加H2O2處理時，fluo-3染色后的細胞在488 nm激發(fā)光激發(fā)下發(fā)出較弱的綠色熒光（圖1）。Fluo-4染色后的細胞在488 nm激發(fā)光激發(fā)下發(fā)出較強的綠色熒光（圖1）。

2.2 H2O2處理的細胞[Ca2+]i變化 在5 mM或10 mM H2O2作用下，fluo-3和fluo-4熒光強度均無明顯變化（結(jié)果未顯示）。加入50 mM H2O2后，細胞熒光強度逐漸增強（圖2），觀察至40 min左右時，熒光強度曲線穩(wěn)定不再變化（圖3）。在實時觀察[Ca2+]i變化過程中，熒光探針fluo-3和fluo-4均未出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象。觀察結(jié)束時，fluo-3熒光強度增加至3.0倍，fluo-4熒光強度增加至2.6倍。H2O2刺激前，fluo-4熒光強度約是fluo-3熒光強度的2.0倍，而H2O2刺激后fluo-4熒光強度約是fluo-3熒光強度的1.8倍（表1）。通過公式計算發(fā)現(xiàn)采用fluo-3探針負載的選定細胞中[Ca2+]i變化范圍是112.2 nM-1,069.6 nM，采用fluo-4探針負載的選定細胞中[Ca2+]i變化范圍是7.6 nM-505.4 nM。

2.3 H2O2誘導(dǎo)細胞凋亡 細胞經(jīng)H2O2刺激后固定，DAPI染色后發(fā)現(xiàn)，凋亡細胞呈現(xiàn)核固縮且染色加深，核染色質(zhì)聚集于核膜一邊，或核碎裂成大小不等的圓形小體（圖4B），而對照組細胞核形態(tài)規(guī)則、染色均勻，呈藍白色熒光（圖4A）。結(jié)果顯示與對照組細胞相比，H2O2處理的細胞凋亡率明顯增加（12.2%±2.3% vs 33.4%±3.2%），有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖2 H2O2刺激后，實時觀察細胞中fluo-3和fluo-4熒光強度變化。141 mm×305 mm（300×300 DPI）。Fig2 The real-time observation of the fluorescence intensity in selected cells loaded with fluo-3 or fluo-4 after H2O2 stimulation. 141 mm×305 mm (300×300 DPI).

3 討論

圖3 H2O2刺激后，選定細胞的fluo-3或fluo-4熒光強度變化曲線。145 mm×50 mm（300×300 DPI）。Fig3 The fluorescence intensity curve of selected cells loaded with fluo-3 or fluo-4 after H2O2 stimulation. 145 mm×50 mm (300×300 DPI).

圖4 H2O2促進A549細胞凋亡。A: 未經(jīng)H2O2處理的細胞；B: H2O2處理的細胞，可見核固縮（→）、染色質(zhì)邊集（△）以及核碎裂（☆）。65 mm×32 mm（300×300 DPI）。Fig 4 H2O2 promoted the apoptosis of A549 cells. H2O2: cells without H2O2 treatment; B: karyopyknosis (→), chromatic condensation (△) and nuclear fragmentation (☆) were observed in H2O2 treated cells. 65 mm×32 mm (300×300 DPI).

表 1 H2O2刺激前后，選定細胞中fluo-3和fluo-4的平均熒光強度值Table 1 The mean value of fluorescence intensity in selected cells loaded with fluo-3 or fluo-4 before and after H2O2 treatment

本研究在對Ca2+信號實時觀察的過程中發(fā)現(xiàn)，較高濃度的H2O2（50 mM）誘導(dǎo)細胞內(nèi)[Ca2+]i迅速升高。由于細胞外液不含有Ca2+，因此[Ca2+]i升高可能是由于細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣庫（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）釋放造成的。有研究[9]表明，H2O2誘導(dǎo)細胞凋亡與鈣超載密切相關(guān)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制非常復(fù)雜，涉及很多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括經(jīng)典的線粒體途徑[10]和死亡受體途徑[11]，以及機制仍不太明確的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[12]。近年來，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response, UPR）扮演著重要角色。研究[13]顯示，細胞的氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放大量Ca2+，同時伴有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引發(fā)UPR，用于ER正常功能的重建。如果細胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)時間較長或非常嚴重，將激活依賴Ca2+的激酶和磷酸酶[14]，如calpain、caspase-12和caspase-3級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞A549在較高濃度的H2O2作用下，細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高，同時發(fā)現(xiàn)細胞短時間內(nèi)即發(fā)生凋亡，推測可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，calpains或caspases信號通路是否被Ca2+激活導(dǎo)致細胞凋亡，還有待于進一步深入研究。本研究中，可能由于腫瘤細胞的生理Ca2+含量較低，或?qū)崟r觀察時間有限，預(yù)實驗時使用較低濃度的H2O2時（5 mM, 10 mM）時，沒有觀察到明顯的[Ca2+]i變化，因此我們采用較高濃度的H2O2刺激細胞，低濃度H2O2對A549細胞其他生物學(xué)行為的影響還有待于進一步研究。

Fluo-3和fluo-4是目前實驗室中常用的Ca2+熒光染料，與Ca2+特異性結(jié)合后熒光強度明顯增加。本研究對fluo-3和fluo-4在H2O2誘導(dǎo)的A549細胞凋亡過程中監(jiān)測[Ca2+]i變化的應(yīng)用情況進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的負載濃度、孵育時間、細胞密度、刺激因素和圖像采集條件下，fluo-4的熒光強度更強，大約是fluo-3的2倍左右，這提示我們當(dāng)細胞內(nèi)Ca2+信號較強時，用fluo-3或fluo-4都可以觀察到明顯的熒光強度的變化，但如果細胞內(nèi)Ca2+信號較弱時，使用 fluo-4探針可能更具優(yōu)勢。細胞經(jīng)H2O2處理后，fluo-3熒光強度的變化范圍大于fluo-4，可能由于熒光探針的Kd值不同，具有較大Kd值的f l uo-3與Ca2+的親和力較低，適合于檢測較寬范圍的[Ca2+]i變化。我們還發(fā)現(xiàn)，采用熒光探針f l uo-3或f l uo-4，通過公式計算測定的細胞內(nèi)[Ca2+]i變化范圍不是很一致，可能與選擇的細胞有關(guān)，不同的細胞對H2O2刺激的反應(yīng)不同，再多重復(fù)幾次實驗，可能會得到比較一致的結(jié)果。

Fluo-3和fluo-4進入細胞的方式均為酯負載法。Fluo-3和fluo-4與具有細胞膜通透性的乙酰甲酯（AM）相連形成Fluo-3 AM和fluo-4 AM復(fù)合物，穿過細胞膜后在細胞內(nèi)被非特異性酯酶水解生成相應(yīng)的Ca2+熒光探針，與Ca2+結(jié)合檢測細胞內(nèi)[Ca2+]i變化。我們在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，含血清的培養(yǎng)基會影響f l uo-3和f l uo-4的負載，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光非常微弱，采集不到良好的熒光信號，這可能是由于含血清的培養(yǎng)基能阻止熒光染料進入細胞。使用標準的無鈣細胞外液，由于沒有血清和培養(yǎng)液的營養(yǎng)支持，對細胞狀態(tài)和活性的影響較大，細胞可能在觀察過程中逐漸皺縮、脫壁或凋亡，不能對細胞進行長時間檢測。

近幾年還出現(xiàn)了熒光強度更強、檢測范圍更寬、更靈敏的Ca2+熒光染料，如fluo-5F、fluo-5N、fluo-4FF，均為fluo-4的類似物，但與Ca2+結(jié)合的親和力較低，更適合于檢測1 μM-1 mM范圍內(nèi)的Ca2+水平變化。Fluo-3和fluo-4測定的Ca2+飽和濃度為≥5 μM，當(dāng)[Ca2+]i升高超過5 μM時，即使有更多的Ca2+出現(xiàn)在細胞中，fluo-3和fluo-4也檢測不到，而fluo-5F、fluo-5N、fluo-4FF測定的Ca2+飽和濃度為≥1 mM，這些新的Ca2+探針可以檢測到更多的Ca2+，在檢測高水平的Ca2+信號時更具優(yōu)勢。Fluo-5F、fluo-4FF的Kd值分別為2.3 μM和9.7 μM，而fluo-5N的Kd值高達90 μM，適合檢測更高濃度的Ca2+變化[16]。研究表明應(yīng)根據(jù)細胞內(nèi)[Ca2+]i的變化水平選擇合適的Ca2+熒光探針，當(dāng)待測Ca2+濃度在熒光染料Kd值的0.1倍-10倍范圍之內(nèi)時其熒光強度與[Ca2+]i呈良好的線性關(guān)系，檢測結(jié)果最準確。

Fluo-3和fluo-4及其類似物均為化學(xué)合成的Ca2+熒光染料，與Ca2+有較高的親和力，通過負載方式很容易進入細胞，但不能在亞細胞水平精確定位，而且可能出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，長時間觀察時對細胞活性有影響。除了Ca2+熒光染料，近年來還出現(xiàn)了水母發(fā)光蛋白和Cameleon等[17]基于生物發(fā)光的Ca2+熒光蛋白探針，需要通過基因轉(zhuǎn)染方式進入細胞，與細胞器特異性基因連接表達重組蛋白，可實現(xiàn)精確的亞細胞定位，長時間觀察其熒光強度穩(wěn)定不會淬滅。目前我們已應(yīng)用Ca2+熒光蛋白Cameleon YC3.6對H2O2刺激后A549細胞中[Ca2+]i進行了測定[18]，但在比較化學(xué)合成的Ca2+熒光探針或Ca2+熒光蛋白這兩種不同的檢測方法方面，還有待于進一步研究。我們應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康摹⒓毎N類、刺激因素以及檢測條件選擇合適的Ca2+熒光探針，以幫助我們深入研究不同刺激條件下腫瘤細胞內(nèi)[Ca2+]i變化，Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)分子機制，以及對腫瘤細胞生物學(xué)行為的影響。