呂俊杰 徐磊 許有濤 邱滿堂 楊欣 王潔 尹榮 許林

微小RNAs（microRNAs, miRNAs）是一類長度為20個(gè)-24個(gè)核苷酸的小的內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNA，通過靶向結(jié)合mRNA的3'非翻譯區(qū)（3′-UTR）導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制[1,2]，從而調(diào)控靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等一系列重要生物學(xué)進(jìn)程。腫瘤的發(fā)展涉及多種基因在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后、翻譯及翻譯后等進(jìn)程，而這些進(jìn)程受到不同的因子調(diào)控[3]。miRNA就是其中一類重要的調(diào)控因子[4]，通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵的癌基因或抑癌因子，miRNAs與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展等密切相關(guān)[5]。目前已發(fā)現(xiàn)的miRNAs約有700多種，miRNA-221是其中一個(gè)重要的miRNA分子。研究[6]表明miRNA-221在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，提示miRNA-221可能是一種潛在的致癌miRNA。近年來，研究者對于miRNA-221在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖遷移等方面研究相對廣泛，然而其在肺癌預(yù)后方面的研究很少。本研究回顧性分析江蘇省腫瘤醫(yī)院117例非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者的臨床資料，并對上述患者肺癌組織標(biāo)本進(jìn)行miRNA-221表達(dá)檢測，分析生存期與該基因表達(dá)之間的關(guān)系，試圖探討miRNA-221作為NSCLC預(yù)后分子標(biāo)志的可能性。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集江蘇省腫瘤醫(yī)院2005年11月-2007年1月期間手術(shù)切除并經(jīng)病理確診為NSCLC的石蠟標(biāo)本117例。所有患者術(shù)前均未接受過放化療。肺癌病理分型及分期標(biāo)準(zhǔn)按照1992年UICC-AJCC（Union for International Cancer Control-American Joint Committee on Cancer）對NSCLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。所有患者都簽署了知情同意書。本研究經(jīng)江蘇省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 高速冷凍離心機(jī)；NanoDropND-1000紫外分光度計(jì)（NanoDrop）；7300 Real-time PCR System(Applied Biosystems公司)、9700 Thermocycler反應(yīng)儀； Recover All Total Nucleic Acid Isolation Kit（Applied Biosystems公司）；has-miRNA-221引物、內(nèi)參RNU6B引物（RiboBio公司）；Real-time逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A）（TakaRa公司）；SYBR? Select Master Mix試劑盒（Applied Biosystems公司）。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR方法

1.3.1 蠟塊組織總RNA提取 利用Recover All Total Nucleic Acid Isolation Kit（Applied Biosystem）試劑盒提取肺癌石蠟組織總RNA, 嚴(yán)格遵照說明書進(jìn)行各操作步驟?？俁NA用50 μL DEPC水稀釋，儲(chǔ)存于-80 °C備用。采用NanoDropND-1000紫外分光度計(jì)測量總RNA OD260/280。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，RNA的量為0.5 μg，冰上加入下列試劑：總RNA 1 μL，5×PrimeScript Buffer 5 mL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，stem-loop RT primer 2 μL，DEPC水，總體積20 μL。所有試劑加入后，42 °C反應(yīng)15 min、85 °C 5 s、4 °C 15 min，后置-80 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系如下：SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上游引物（5 μM）1 μL，下游引物（5 μM）1 μL，cDNA 2 μL，加DEPC水至20 μL。將反應(yīng)管置7300 Real-time PCR反應(yīng)儀（Applied Biosystem）中，反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性 10 min后，按下述條件擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)：95 °C 15 s，60 °C 1 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4 隨訪 所有117例患者進(jìn)行電話和書信形式隨訪，了解生存情況等信息，隨訪截止日期為2011年3月，中位隨訪時(shí)間40個(gè)月（范圍3個(gè)月-64個(gè)月）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 MiRNA-221相對表達(dá)量采用2-△△Ct方法[7]，△△Ct = △Ct - Avg.△Ct = (CtmiRNA-221 - CtU6) -Avg.(CtmiRNA-221 - CtU6)。把2-△△Ct中位數(shù)作為分界值，將患者分為miRNA-221低表達(dá)組和高表達(dá)組。MiRNA-221表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，并采用Log-rank檢驗(yàn)比較兩組生存率；采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行各個(gè)協(xié)變量的聯(lián)合效應(yīng)分析。應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料 在117例NSCLC患者中，男性86例，女31例。中位年齡60歲（范圍：41歲-79歲）。病理證實(shí)為腺癌72例，鱗癌45例。病理分期I期41例，II期-IIIa期76例。其中44例無吸煙史，73例有吸煙史。具體見表1。

2.2 miRNA-221表達(dá)與NSCLC患者臨床資料關(guān)系 根據(jù)miRNA-221的表達(dá)，肺癌患者被相對分為miRNA-211高表達(dá)和低表達(dá)組。117例NSCLC組織中，59例miR-211相對高表達(dá)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，miRNA-221的表達(dá)量與患者年齡（χ2=4.547, P=0.033）相關(guān)。其中60歲以上肺癌患者組織中有25例miRNA-221呈高表達(dá)，36例低表達(dá)；60歲以下患者中，miRNA-221呈高表達(dá)34例，低表達(dá)22例。miRNA-221的表達(dá)量與性別（χ2=0.070, P=0.791）、病理類型（χ2=0.414, P=0.520）、p-TNM分期（χ2=0.068,P=0.794）及吸煙史（χ2=0.206, P=0.650）均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

2.3 miRNA-221表達(dá)與NSCLC患者生存時(shí)間的關(guān)系 利用Kaplan-Meier對117例患者進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示：miR-211高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間35.34個(gè)月，較miRNA-221低表達(dá)組患者（平均48.72個(gè)月）明顯縮短，兩組生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank檢驗(yàn)：P=0.006）（圖1）。Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型單因素分析顯示：肺癌p-TNM分期偏晚（P=0.003）和miR-211高表達(dá)（P=0.007）與NSCLC患者預(yù)后相關(guān)（表2）。 根據(jù)Cox回歸模型多因素分析的結(jié)果，p-TNM分期偏晚（P=0.004）和miR-211高表達(dá)（P=0.005）是NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表2）。

3 討論

NSCLC主要包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌，約占據(jù)全球因癌癥死亡患者的1/6[8]。盡管在臨床與實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)方面均取得很多進(jìn)展，但肺癌的預(yù)后仍然不佳，5年總體生存率大約11%[9]。因此，了解詳細(xì)的機(jī)制對于診斷、預(yù)防和治療NSCLC是必不可少的。最近，越來越多的證據(jù)[10]表明，miRNAs參與NSCLC的發(fā)病機(jī)制；miRNAs可作為一項(xiàng)工具來調(diào)控與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路和一些關(guān)鍵基因或因子，與腫瘤分化、發(fā)生、侵潤和轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)。而miRNA-221是miRNAs大家族的重要一員，位于人類X染色體p11.3。文獻(xiàn)表明miRNA-221在腦膠質(zhì)瘤[11]、甲狀腺乳頭狀癌[12]、乳腺癌[13]、肝細(xì)胞癌[14]、前列腺癌[15]和卵巢癌[16]等多種癌癥中高表達(dá)，在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮類似于致癌基因的作用。研究發(fā)現(xiàn)在這些腫瘤中，過表達(dá)的miRNA-221可以靶向作用于重要的腫瘤抑制基因如P27/Kip1、P57、Puma、ER-α、FOXO3、PTEN、TIMP3、DDIT4、Bim，繼而激活細(xì)胞周期和AKT旁路或阻斷TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL），誘導(dǎo)腫瘤增殖和侵襲；而在舌鱗癌和甲狀腺癌中，miRNA-221也可以作用c-Kit或 MMP1抑制腫瘤增殖，起著抑癌miRNA的作用[6]。此外Garofalo等[17,18]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中過表達(dá)的miRNA211可以靶向結(jié)合抑癌基因PTEN和TIMP3，通過激活A(yù)KT旁路和金屬鈦酶從而誘導(dǎo)TRAIL抵抗和促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤。這些發(fā)現(xiàn)提示了miRNA-221在肺癌中可能起著關(guān)鍵的作用。

表 1 miRNA-221表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab 1 Correlation of miRNA-221 expression and the clinical characteristics of 117 NSCLC patients

表 2 NSCLC患者總生存期單因素及多因素Cox回歸分析Tab 2 Univariate and multivariate analyses of overall survival (OS) of 117 NSCLC patients

圖 1 不同miRNA-221表達(dá)水平NSCLC患者的生存分析Fig 1 Survival analysis of different miRNA-221 expression in NSCLC patients

本研究回顧分析了我院117例NSCLC患者的臨床資料，并采用RT-PCR方法對上述肺癌患者組織標(biāo)本中miRNA-221的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，應(yīng)用Kaplan-Meier法研究miRNA-221在NSCLC預(yù)后方面的意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，117例NSCLC患者的臨床病理資料中，miRNA-221表達(dá)與性別、病理類型及分期、吸煙史等無明顯相關(guān)；卡方分析提示miRNA-221表達(dá)量與患者年齡相關(guān)，而Cox單變量和多變量分析表明總生存期與年齡無關(guān)，可以認(rèn)為miRNA-211表達(dá)與年齡相關(guān)沒有臨床意義。Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型單因素分析顯示miRNA-221高表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后呈明顯相關(guān)，多因素分析表明miR-221高表達(dá)（P=0.005）是NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而生存分析提示miRNA-221表達(dá)與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)，即微小RNA-221表達(dá)水平高的患者生存時(shí)間較短。以上結(jié)果表明miRNA-221可能是NSCLC預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。

本研究為回顧性研究，臨床資料不夠完善，例如缺少瘤旁組織和腫瘤組織的對照。對于肺癌患者的分組也可以更加地嚴(yán)格和精確，比如針對更細(xì)致的病理分期或分化程度進(jìn)行分組。

綜上所述，miRNA-221高表達(dá)提示NSCLC預(yù)后較差，miRNA-221可作為NSCLC預(yù)后的一個(gè)重要分子標(biāo)志。未來值得進(jìn)一步開展嚴(yán)格的前瞻性臨床研究進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果的可靠性。