魯戰(zhàn)勝 郭麗麗 李林 吳志浩 周清華

Nm23-H1基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，為nm23基因家族8個(gè)成員之一[1,2]，該基因與人類多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。已有的研究表明：nm23-H1具有多種酶的活性[3-6]，其44位絲氨酸的磷酸化水平與其腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能有關(guān)；118位的組氨酸突變?yōu)楸奖彼幔瑔适Ш塑斩姿峒っ富钚?，但不影響其腫瘤抑制功能；96位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸和120位的絲氨酸突變?yōu)楦拾彼釀t保留了核苷二磷酸激酶活性，喪失了組氨酸依賴的蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，其不同特定堿基的突變改變了其蛋白酶活性并影響到腫瘤的生物學(xué)行為。為此，本研究應(yīng)用重疊延伸PCR方法構(gòu)建shRNA（NM_000269.x-99s1c1:GCGTACCTTCATTGCGATCAA）抵抗的nm23-H1S44A、nm23-H1P96S、nm23-H1H118F、nm23-H1S120G、nm23-H1P96S-S120G五個(gè)突變型真核表達(dá)載體并驗(yàn)證其表達(dá)，從而為進(jìn)一步揭示nm23-H1基因在腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)通路的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 pcDNA3.1Hygro(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存；菌種大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pcDNA3.1(+)-shRNA-resistant-nm23-H1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Roche公司；Goldview購(gòu)自北京賽百盛公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA連接試劑盒均購(gòu)自QIAGEN公司；限制性內(nèi)切酶BamH1、Xba1購(gòu)自NEB公司；核酸Marker購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；nm23-H1鼠單抗、β-actin鼠單抗購(gòu)自CST公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純；引物合成及DNA測(cè)序均由華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒提取 搖菌擴(kuò)增質(zhì)粒，HiSpeed Plasmid Midi Kit提取質(zhì)粒，紫外分光光度儀測(cè)定質(zhì)粒濃度及純度。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 包括側(cè)翼引物和突變引物（表1和表2），根據(jù)GenBank報(bào)道的nm23-H1cDNA序列號(hào)（X17620）、重疊延伸PCR定點(diǎn)突變?cè)?、nm23-H1基因shRNA抵抗突變堿基序列及載體pcDNA3.1Hygro(+)圖譜，利用Oligo7軟件共設(shè)計(jì)1對(duì)側(cè)翼引物及4對(duì)突變引物。側(cè)翼引物上游酶切位點(diǎn)BamH1:GGATCC，下游酶切位點(diǎn)Xba1:TCTAGA；4個(gè)突變點(diǎn)分別為44位的絲氨酸（TCC）突變?yōu)楸彼幔℅CC）S44A，96位的脯氨酸（CCT）突變?yōu)榻z氨酸（TCT）P96S，118位的組氨酸（CAT）突變?yōu)楸奖彼幔═TT）H118F，120位的絲氨酸（AGT）突變?yōu)楦拾彼幔℅GT）S120G。

1.2.3 突變反應(yīng) 每個(gè)待突變位點(diǎn)需要3個(gè)PCR反應(yīng)來完成。首先以質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-shRNA-resistantnm23-H1為模板，正向側(cè)翼引物F和突變引物Rm為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（PCR1），擴(kuò)增突變位點(diǎn)及其上游序列的DNA片段，產(chǎn)物命名P1，同時(shí)也以質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-shRNA-resistant-nm23-H1為模板，以突變引物Fm和反向側(cè)翼引物R為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（PCR2），擴(kuò)增含突變位點(diǎn)及其下游序列的DNA片段，產(chǎn)物命名為P2。最后取P1和P2各1 μL為模板，以正、反向側(cè)翼引物F和R為上下游引物進(jìn)行第3次PCR擴(kuò)增（PCR3），用外側(cè)引物將P1和P2拼接而成含突變位點(diǎn)的目的產(chǎn)物。PCR反應(yīng)總體積均為25 μL：10×Buffer 2.5 μL，Taq DNA polymerase 0.5 μL，dNTPs（10 mM）1 μL，正、反向引物（20 μM）各0.5 μL，模板質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-shRNA-resistant-nm23-H1（230 ng/μL）0.5 μL，模板P1、P2各1 μL，余用雙蒸水補(bǔ)足。PCR循環(huán)條件均為94oC預(yù)變性2 min；94oC變性30 s，60oC退火30 s，72oC延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；末次循環(huán)后，72oC再延伸8 min，4oC終止循環(huán)。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒將第3次PCR循環(huán)結(jié)束后產(chǎn)物純化，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1），與目的片段大?。?59 bp）相符，在nm23-H1H118F片段泳道可見一雜帶，應(yīng)用NDA凝膠回收試劑盒將雜帶去除。

表 1 側(cè)翼引物Tab 1 Outside primers

表 2 突變引物Tab 2 Mutation primers

1.2.4 聯(lián)合位點(diǎn)（P96S-S120G）突變方法 以片段大小相符的nm23-H1P96SPCR純化產(chǎn)物為模板進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)，操作步驟同前。

1.2.5 目的基因片段與載體連接克隆 將載體pcDNA3.1Hygro(+)及PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行BamH1、Xba1雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物再次純化，以DNA連接試劑盒連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌。取200 μL菌液涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板中，37oC搖床過夜，挑取陽(yáng)性菌落小搖。

1.2.6 轉(zhuǎn)染及Western blot驗(yàn)證nm23-H1蛋白表達(dá) 脂質(zhì)體法將shRNA抵抗nm23-H1基因重組突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默nm23-H1基因表達(dá)的肺癌細(xì)胞株A549/nm23-H1-shRNA，48 h后細(xì)胞裂解后提取總蛋白，測(cè)定濃度后進(jìn)行12%SDSPAGE電泳。100 V轉(zhuǎn)膜1 h，抗nm23-H1和β-actin一抗4oC孵育過夜，洗膜后室溫二抗孵育1 h，ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1 突變載體菌液PCR鑒定 取菌液1 μL為模板，以側(cè)翼正、反向引物為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所得片段與目的基因大?。?59 bp）相符（圖2）。

2.2 突變載體DNA測(cè)序結(jié)果 構(gòu)建的4個(gè)單點(diǎn)突變型和1個(gè)聯(lián)合位點(diǎn)突變型抗shRNA nm23-H1基因，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證，堿基突變結(jié)果與預(yù)期完全一致，抗shRNA堿基序列未發(fā)生改變（圖3）。

2.3 shRNA抵抗nm23-H1基因重組突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染恢復(fù)實(shí)驗(yàn)將shRNA抵抗nm23-H1基因重組突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默nm23-H1基因表達(dá)的肺癌細(xì)胞株A549/nm23-H1-shRNA，48 h后收獲細(xì)胞蛋白作Western blot檢測(cè)，顯示恢復(fù)了nm23-H1蛋白的正常表達(dá)（圖4）。

3 討論

基于PCR方法的定點(diǎn)突變是指在基因的特定位點(diǎn)引入突變，有目的改變DNA序列中的堿基，是研究基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的有力工具[7,8]。重疊延伸PCR技術(shù)采用互補(bǔ)引物，使PCR產(chǎn)物之間形成重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸將不同來源的擴(kuò)增片段拼接起來，其成功的關(guān)鍵在于突變引物的設(shè)計(jì)，重疊部分應(yīng)設(shè)計(jì)20個(gè)堿基左右，并且使引物的Tm值彼此接近。此技術(shù)利用PCR可以在體外進(jìn)行有效的基因重組，并可在側(cè)翼引物加入限制性酶切位點(diǎn)，可以將突變成功的基因片段克隆到目的載體上，比依靠試劑盒內(nèi)切酶消化[9]的基因突變方法靈活、經(jīng)濟(jì)，后者需要事先克隆載體且后期篩選假陽(yáng)性率高。重疊延伸PCR幾乎沒有任何特殊條件的限制，而且成功率很高，可利用這一技術(shù)很快獲得其他依靠?jī)?nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物，因此運(yùn)用非常廣泛。本實(shí)驗(yàn)即是利用該技術(shù)通過設(shè)計(jì)突變引物和側(cè)翼引物，并在側(cè)翼引物加入酶切位點(diǎn)成功克隆到四個(gè)單點(diǎn)定點(diǎn)突變載體和一個(gè)聯(lián)合位點(diǎn)突變載體，經(jīng)驗(yàn)證與預(yù)期相符。

Nm23基因是美國(guó)國(guó)立癌癥研究所的Steeg[1]等于1988年用消減雜交分離的方法篩選7個(gè)K-1735小鼠黑色素瘤細(xì)胞株時(shí)發(fā)現(xiàn)并分離出來的cDNA克隆，顯示在2個(gè)低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中其mRNA表達(dá)較另外5個(gè)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株高10倍，隨后在蛋白水平的檢測(cè)中也有類似發(fā)現(xiàn)。Nm23基因是一個(gè)具有高度同源性的保守基因家族，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、植物、果蠅、鼠及人類在內(nèi)的眾多生物物種之中。迄今人類nm23基因家族已經(jīng)發(fā)現(xiàn)8個(gè)成員，即nm23-H1至nm23-H8。其中nm23-H1亞型與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系最為密切，其mRNA由533個(gè)核苷酸組成，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含有152個(gè)氨基酸，編碼核苷二磷酸激酶-A（NDPK-A），分子量約為17 kDa，該基因具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移潛能而不影響腫瘤大小的能力[10]。

圖1 PCR結(jié)果Fig1 PCR amplification products were obtained by an overlap extension PCR

圖2 菌液PCR電泳結(jié)果Fig2 PCR amplification products from the bacteria

圖3 測(cè)序結(jié)果Fig3 Results of sequencing

圖4 A549/nm23-H1-shRNA細(xì)胞基因重組質(zhì)粒恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組相比nm23-H基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組重現(xiàn)nm23-H1蛋白的正常表達(dá)Fig4 shRNA rescue experiment in A549/nm23-H1-shRNA cells analyzed by Western blot

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。Nm23-H1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力在多種腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)，因此其抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的分子機(jī)理研究得到了持續(xù)的關(guān)注。同樣在肺癌的基礎(chǔ)研究中，nm23-H1基因被證明起著“轉(zhuǎn)移抑制級(jí)聯(lián)”[11,12]的作用，作為靶基因通過級(jí)聯(lián)效應(yīng)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)從而抑制肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移表型，精細(xì)調(diào)控著細(xì)胞的多種生理功能，但其在抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力方面的分子機(jī)制尚未闡明。

本實(shí)驗(yàn)室研究工作已經(jīng)證明腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H低表達(dá)、雜合性缺失和突變與肺癌的高轉(zhuǎn)移性和預(yù)后不良密切相關(guān)，其編碼蛋白核苷二磷酸激酶-A的酶活性可能在抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移方面起著重要作用。而已有的研究[11-19]表明nm23-H1基因編碼蛋白具有3′→5′核酸外切酶、核苷二磷酸激酶和組氨酸蛋白激酶等多種酶的活性，并且相關(guān)研究顯示，突變的nm23-H1基因蛋白在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及信號(hào)傳導(dǎo)方面具有多種功能，其44位絲氨酸的磷酸化水平與其腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能有關(guān)；118位的組氨酸突變?yōu)楸奖彼?，喪失核苷二磷酸激酶活性，但不影響其腫瘤抑制功能；96位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸和120位的絲氨酸突變?yōu)楦拾彼釀t保留了核苷二磷酸激酶活性，喪失了組氨酸依賴的蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。本研究通過設(shè)計(jì)五個(gè)定點(diǎn)突變來改變其上述的相關(guān)酶活性，以shRNA抵抗的nm23-H1cDNA為模板利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建了shRNA抵抗的四個(gè)單點(diǎn)突變載體和一個(gè)聯(lián)合位點(diǎn)突變載體，經(jīng)鑒定符合預(yù)期要求，并驗(yàn)證了其蛋白表達(dá)，為下一步轉(zhuǎn)染shRNA抵抗的A549肺癌細(xì)胞株[17]研究nm23-H1基因在腫瘤轉(zhuǎn)移抑制及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的生化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。