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        具有不同酶活性并可抵抗特異shRNA降解的nm23-H1真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)

        2014-09-05 05:06:06魯戰(zhàn)勝郭麗麗李林吳志浩周清華
        中國(guó)肺癌雜志 2014年3期

        魯戰(zhàn)勝 郭麗麗 李林 吳志浩 周清華

        Nm23-H1基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,為nm23基因家族8個(gè)成員之一[1,2],該基因與人類多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。已有的研究表明:nm23-H1具有多種酶的活性[3-6],其44位絲氨酸的磷酸化水平與其腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能有關(guān);118位的組氨酸突變?yōu)楸奖彼幔瑔适Ш塑斩姿峒っ富钚?,但不影響其腫瘤抑制功能;96位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸和120位的絲氨酸突變?yōu)楦拾彼釀t保留了核苷二磷酸激酶活性,喪失了組氨酸依賴的蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶活性,其不同特定堿基的突變改變了其蛋白酶活性并影響到腫瘤的生物學(xué)行為。為此,本研究應(yīng)用重疊延伸PCR方法構(gòu)建shRNA(NM_000269.x-99s1c1:GCGTACCTTCATTGCGATCAA)抵抗的nm23-H1S44A、nm23-H1P96S、nm23-H1H118F、nm23-H1S120G、nm23-H1P96S-S120G五個(gè)突變型真核表達(dá)載體并驗(yàn)證其表達(dá),從而為進(jìn)一步揭示nm23-H1基因在腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)通路的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 材料 pcDNA3.1Hygro(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存;菌種大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pcDNA3.1(+)-shRNA-resistant-nm23-H1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Roche公司;Goldview購(gòu)自北京賽百盛公司;質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA連接試劑盒均購(gòu)自QIAGEN公司;限制性內(nèi)切酶BamH1、Xba1購(gòu)自NEB公司;核酸Marker購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司;nm23-H1鼠單抗、β-actin鼠單抗購(gòu)自CST公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純;引物合成及DNA測(cè)序均由華大基因公司完成。

        1.2 方法

        1.2.1 質(zhì)粒提取 搖菌擴(kuò)增質(zhì)粒,HiSpeed Plasmid Midi Kit提取質(zhì)粒,紫外分光光度儀測(cè)定質(zhì)粒濃度及純度。

        1.2.2 引物設(shè)計(jì) 包括側(cè)翼引物和突變引物(表1和表2),根據(jù)GenBank報(bào)道的nm23-H1cDNA序列號(hào)(X17620)、重疊延伸PCR定點(diǎn)突變?cè)?、nm23-H1基因shRNA抵抗突變堿基序列及載體pcDNA3.1Hygro(+)圖譜,利用Oligo7軟件共設(shè)計(jì)1對(duì)側(cè)翼引物及4對(duì)突變引物。側(cè)翼引物上游酶切位點(diǎn)BamH1:GGATCC,下游酶切位點(diǎn)Xba1:TCTAGA;4個(gè)突變點(diǎn)分別為44位的絲氨酸(TCC)突變?yōu)楸彼幔℅CC)S44A,96位的脯氨酸(CCT)突變?yōu)榻z氨酸(TCT)P96S,118位的組氨酸(CAT)突變?yōu)楸奖彼幔═TT)H118F,120位的絲氨酸(AGT)突變?yōu)楦拾彼幔℅GT)S120G。

        1.2.3 突變反應(yīng) 每個(gè)待突變位點(diǎn)需要3個(gè)PCR反應(yīng)來完成。首先以質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-shRNA-resistantnm23-H1為模板,正向側(cè)翼引物F和突變引物Rm為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR1),擴(kuò)增突變位點(diǎn)及其上游序列的DNA片段,產(chǎn)物命名P1,同時(shí)也以質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-shRNA-resistant-nm23-H1為模板,以突變引物Fm和反向側(cè)翼引物R為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR2),擴(kuò)增含突變位點(diǎn)及其下游序列的DNA片段,產(chǎn)物命名為P2。最后取P1和P2各1 μL為模板,以正、反向側(cè)翼引物F和R為上下游引物進(jìn)行第3次PCR擴(kuò)增(PCR3),用外側(cè)引物將P1和P2拼接而成含突變位點(diǎn)的目的產(chǎn)物。PCR反應(yīng)總體積均為25 μL:10×Buffer 2.5 μL,Taq DNA polymerase 0.5 μL,dNTPs(10 mM)1 μL,正、反向引物(20 μM)各0.5 μL,模板質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-shRNA-resistant-nm23-H1(230 ng/μL)0.5 μL,模板P1、P2各1 μL,余用雙蒸水補(bǔ)足。PCR循環(huán)條件均為94oC預(yù)變性2 min;94oC變性30 s,60oC退火30 s,72oC延伸45 s,共30個(gè)循環(huán);末次循環(huán)后,72oC再延伸8 min,4oC終止循環(huán)。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒將第3次PCR循環(huán)結(jié)束后產(chǎn)物純化,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖1),與目的片段大?。?59 bp)相符,在nm23-H1H118F片段泳道可見一雜帶,應(yīng)用NDA凝膠回收試劑盒將雜帶去除。

        表 1 側(cè)翼引物Tab 1 Outside primers

        表 2 突變引物Tab 2 Mutation primers

        1.2.4 聯(lián)合位點(diǎn)(P96S-S120G)突變方法 以片段大小相符的nm23-H1P96SPCR純化產(chǎn)物為模板進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng),操作步驟同前。

        1.2.5 目的基因片段與載體連接克隆 將載體pcDNA3.1Hygro(+)及PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行BamH1、Xba1雙酶切反應(yīng),酶切產(chǎn)物再次純化,以DNA連接試劑盒連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌。取200 μL菌液涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板中,37oC搖床過夜,挑取陽(yáng)性菌落小搖。

        1.2.6 轉(zhuǎn)染及Western blot驗(yàn)證nm23-H1蛋白表達(dá) 脂質(zhì)體法將shRNA抵抗nm23-H1基因重組突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默nm23-H1基因表達(dá)的肺癌細(xì)胞株A549/nm23-H1-shRNA,48 h后細(xì)胞裂解后提取總蛋白,測(cè)定濃度后進(jìn)行12%SDSPAGE電泳。100 V轉(zhuǎn)膜1 h,抗nm23-H1和β-actin一抗4oC孵育過夜,洗膜后室溫二抗孵育1 h,ECL顯影。

        2 結(jié)果

        2.1 突變載體菌液PCR鑒定 取菌液1 μL為模板,以側(cè)翼正、反向引物為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),所得片段與目的基因大?。?59 bp)相符(圖2)。

        2.2 突變載體DNA測(cè)序結(jié)果 構(gòu)建的4個(gè)單點(diǎn)突變型和1個(gè)聯(lián)合位點(diǎn)突變型抗shRNA nm23-H1基因,經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證,堿基突變結(jié)果與預(yù)期完全一致,抗shRNA堿基序列未發(fā)生改變(圖3)。

        2.3 shRNA抵抗nm23-H1基因重組突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染恢復(fù)實(shí)驗(yàn)將shRNA抵抗nm23-H1基因重組突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默nm23-H1基因表達(dá)的肺癌細(xì)胞株A549/nm23-H1-shRNA,48 h后收獲細(xì)胞蛋白作Western blot檢測(cè),顯示恢復(fù)了nm23-H1蛋白的正常表達(dá)(圖4)。

        3 討論

        基于PCR方法的定點(diǎn)突變是指在基因的特定位點(diǎn)引入突變,有目的改變DNA序列中的堿基,是研究基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的有力工具[7,8]。重疊延伸PCR技術(shù)采用互補(bǔ)引物,使PCR產(chǎn)物之間形成重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸將不同來源的擴(kuò)增片段拼接起來,其成功的關(guān)鍵在于突變引物的設(shè)計(jì),重疊部分應(yīng)設(shè)計(jì)20個(gè)堿基左右,并且使引物的Tm值彼此接近。此技術(shù)利用PCR可以在體外進(jìn)行有效的基因重組,并可在側(cè)翼引物加入限制性酶切位點(diǎn),可以將突變成功的基因片段克隆到目的載體上,比依靠試劑盒內(nèi)切酶消化[9]的基因突變方法靈活、經(jīng)濟(jì),后者需要事先克隆載體且后期篩選假陽(yáng)性率高。重疊延伸PCR幾乎沒有任何特殊條件的限制,而且成功率很高,可利用這一技術(shù)很快獲得其他依靠?jī)?nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物,因此運(yùn)用非常廣泛。本實(shí)驗(yàn)即是利用該技術(shù)通過設(shè)計(jì)突變引物和側(cè)翼引物,并在側(cè)翼引物加入酶切位點(diǎn)成功克隆到四個(gè)單點(diǎn)定點(diǎn)突變載體和一個(gè)聯(lián)合位點(diǎn)突變載體,經(jīng)驗(yàn)證與預(yù)期相符。

        Nm23基因是美國(guó)國(guó)立癌癥研究所的Steeg[1]等于1988年用消減雜交分離的方法篩選7個(gè)K-1735小鼠黑色素瘤細(xì)胞株時(shí)發(fā)現(xiàn)并分離出來的cDNA克隆,顯示在2個(gè)低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中其mRNA表達(dá)較另外5個(gè)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株高10倍,隨后在蛋白水平的檢測(cè)中也有類似發(fā)現(xiàn)。Nm23基因是一個(gè)具有高度同源性的保守基因家族,廣泛存在于細(xì)菌、酵母、植物、果蠅、鼠及人類在內(nèi)的眾多生物物種之中。迄今人類nm23基因家族已經(jīng)發(fā)現(xiàn)8個(gè)成員,即nm23-H1至nm23-H8。其中nm23-H1亞型與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系最為密切,其mRNA由533個(gè)核苷酸組成,產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含有152個(gè)氨基酸,編碼核苷二磷酸激酶-A(NDPK-A),分子量約為17 kDa,該基因具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移潛能而不影響腫瘤大小的能力[10]。

        圖1 PCR結(jié)果Fig1 PCR amplification products were obtained by an overlap extension PCR

        圖2 菌液PCR電泳結(jié)果Fig2 PCR amplification products from the bacteria

        圖3 測(cè)序結(jié)果Fig3 Results of sequencing

        圖4 A549/nm23-H1-shRNA細(xì)胞基因重組質(zhì)粒恢復(fù)實(shí)驗(yàn),與對(duì)照組相比nm23-H基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組重現(xiàn)nm23-H1蛋白的正常表達(dá)Fig4 shRNA rescue experiment in A549/nm23-H1-shRNA cells analyzed by Western blot

        侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征,也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。Nm23-H1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,其抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力在多種腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí),因此其抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的分子機(jī)理研究得到了持續(xù)的關(guān)注。同樣在肺癌的基礎(chǔ)研究中,nm23-H1基因被證明起著“轉(zhuǎn)移抑制級(jí)聯(lián)”[11,12]的作用,作為靶基因通過級(jí)聯(lián)效應(yīng)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)從而抑制肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移表型,精細(xì)調(diào)控著細(xì)胞的多種生理功能,但其在抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力方面的分子機(jī)制尚未闡明。

        本實(shí)驗(yàn)室研究工作已經(jīng)證明腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H低表達(dá)、雜合性缺失和突變與肺癌的高轉(zhuǎn)移性和預(yù)后不良密切相關(guān),其編碼蛋白核苷二磷酸激酶-A的酶活性可能在抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移方面起著重要作用。而已有的研究[11-19]表明nm23-H1基因編碼蛋白具有3′→5′核酸外切酶、核苷二磷酸激酶和組氨酸蛋白激酶等多種酶的活性,并且相關(guān)研究顯示,突變的nm23-H1基因蛋白在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及信號(hào)傳導(dǎo)方面具有多種功能,其44位絲氨酸的磷酸化水平與其腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能有關(guān);118位的組氨酸突變?yōu)楸奖彼?,喪失核苷二磷酸激酶活性,但不影響其腫瘤抑制功能;96位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸和120位的絲氨酸突變?yōu)楦拾彼釀t保留了核苷二磷酸激酶活性,喪失了組氨酸依賴的蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。本研究通過設(shè)計(jì)五個(gè)定點(diǎn)突變來改變其上述的相關(guān)酶活性,以shRNA抵抗的nm23-H1cDNA為模板利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建了shRNA抵抗的四個(gè)單點(diǎn)突變載體和一個(gè)聯(lián)合位點(diǎn)突變載體,經(jīng)鑒定符合預(yù)期要求,并驗(yàn)證了其蛋白表達(dá),為下一步轉(zhuǎn)染shRNA抵抗的A549肺癌細(xì)胞株[17]研究nm23-H1基因在腫瘤轉(zhuǎn)移抑制及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的生化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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