周清華 祖玲玲 李潞 陳曉禾 陳曉峰 李洋 劉紅雨 孫芝琳

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。肺癌是男性死亡率和發(fā)病率均為首位，女性發(fā)病率第二位，死亡率第一位的腫瘤[1-7]。近30年來，全世界肺癌發(fā)病率和死亡率不斷增長，但總的治愈率卻沒有明顯提高，5年生存率低于15%[1,8-14]。肺癌高死亡率的主要原因是大約50%的患者就診時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，30%-40%的患者在治療過程中發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15-18]。肺癌轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標(biāo)志和生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致治療失敗和死亡的最主要原因[2-7]。肺癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)有多基因參與調(diào)控、涉及多信號(hào)通路、多階段、多步奏發(fā)生的復(fù)雜過程[7,9]。已有的研究證明：體外培養(yǎng)和建立人肺癌細(xì)胞系對(duì)于研究肺癌癌變、侵襲轉(zhuǎn)移、多藥耐藥的分子機(jī)理、生物學(xué)特征，以及開發(fā)抗肺癌新藥等均有十分重要的理論和臨床意義[8,14-18]。研究肺癌轉(zhuǎn)移的有效方法是利用具有相同遺傳背景、不同轉(zhuǎn)移潛能、基因和信號(hào)調(diào)節(jié)途徑的肺癌細(xì)胞株作為天然對(duì)比材料[8]。等經(jīng)過多年對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其理論核心是：腫瘤本質(zhì)上是由多克隆異質(zhì)性細(xì)胞所組成，轉(zhuǎn)移之所以發(fā)生，主要是由于具有高轉(zhuǎn)移能力的克隆株細(xì)胞存在于腫瘤細(xì)胞群體之中。已有的研究[19-29]證明：肺癌與其他腫瘤一樣其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有器官特異性選擇。目前，國內(nèi)外已經(jīng)構(gòu)建了前例腺癌、乳腺癌、肝癌和胰腺癌器官特異性轉(zhuǎn)移細(xì)胞株[19-29]，但迄今國內(nèi)外均無有關(guān)肺癌器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株的報(bào)道。為了篩選鑒定和建立具有器官特異性轉(zhuǎn)移的人肺癌細(xì)胞株，我們應(yīng)有我們實(shí)驗(yàn)室獨(dú)有的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981為材料，通過體內(nèi)外篩選以期篩選出具有靶向器官特異性侵襲轉(zhuǎn)移潛能的肺癌細(xì)胞株，為進(jìn)一步的研究肺癌靶向器官特異轉(zhuǎn)移提供科學(xué)可靠的細(xì)胞模型。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器 ①母系高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株：L9981-Luc。L9981-Luc是應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)篩選的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981，轉(zhuǎn)染Luciferanse ，篩選鑒定后，細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)Luciferanse的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株。②細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI-1640。③細(xì)胞培養(yǎng)基：購自美國Sigma公司。④精制小牛血清：購自美國Gibico公司。⑤胰蛋白酶：購自Amresco公司。⑥原代細(xì)胞培養(yǎng)基：購自美國JIBICO公司⑦動(dòng)物活體成像儀：IVIS200型，購自美國精若真公司。⑧倒置熒光相差顯微鏡：尼康TE-2000型，購自日本尼康公司。

1.2 主要研究方法 從液氮罐取出L9981-Luc細(xì)胞株，復(fù)蘇后，常規(guī)培養(yǎng)，等到細(xì)胞株貼壁生長良好后，將1×105母系肺癌細(xì)胞株L9981-Luc接種到裸鼠皮下腹股溝皮下，每周一次應(yīng)用動(dòng)物活體成像儀對(duì)荷裸鼠進(jìn)行活體成像，觀察母系肺癌細(xì)胞株L9981-Luc在裸鼠體內(nèi)的成瘤性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。當(dāng)活體成像觀察到母系肺癌細(xì)胞株L9981-Luc在遠(yuǎn)處形轉(zhuǎn)移瘤后，處死裸鼠，在無菌情況下解剖出裸鼠的肺癌轉(zhuǎn)移器官（肺、大腦、脊柱和縱隔淋巴結(jié)），并子無菌條件下解剖出相應(yīng)的肺癌器官特異性瘤結(jié)節(jié)。在無菌條件下，在培養(yǎng)基中將相應(yīng)的肺癌器官特異性瘤結(jié)節(jié)切成細(xì)碎片，并進(jìn)行器官特異性轉(zhuǎn)移的原代培養(yǎng)。當(dāng)原代培養(yǎng)的器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株貼壁生長良好后，將大部分原代培養(yǎng)器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株在液氮中凍存，將1×105原代培養(yǎng)器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株分別接種到裸鼠皮下腹股溝皮下，每周一次應(yīng)用動(dòng)物活體成像儀對(duì)荷裸鼠進(jìn)行活體成像，觀察原代培養(yǎng)器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)的成瘤性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。當(dāng)活體成像觀察到在原代培養(yǎng)的器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移瘤后，處死裸鼠，在無菌情況下解剖出裸鼠的肺癌轉(zhuǎn)移器官（肺、大腦、脊柱和縱隔淋巴結(jié)），并子無菌條件下解剖出相應(yīng)的肺癌器官特異性瘤結(jié)節(jié)。在無菌條件下，在培養(yǎng)基中將相應(yīng)的肺癌器官特異性瘤結(jié)節(jié)切成細(xì)碎片，并進(jìn)行器官特異性轉(zhuǎn)移的原代培養(yǎng)。經(jīng)過如此反復(fù)的蔣器官特異性轉(zhuǎn)移原代肺癌細(xì)胞株進(jìn)行體內(nèi)外篩選后，篩選建立成功4株人器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株（篩選流程見圖1）。

圖1 高器官靶向特異性轉(zhuǎn)移潛能肺癌細(xì)胞株篩選流程圖Fig 1 Work flow of screening human lung cancer cell lines with high tissue-specific metastasis potential

2 結(jié)果

2.1 器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株成瘤性及器官靶向轉(zhuǎn)移率比較 母系肺癌細(xì)胞株L9981-Luc為對(duì)照，4株器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株（L9981-LuM, L9981-LnM, L9981-BrM,L9981-BoM）為實(shí)驗(yàn)組，分別接種裸鼠，評(píng)估器官特異性轉(zhuǎn)移在裸鼠體內(nèi)性成瘤率和器官特異性轉(zhuǎn)移百分比。每組5只裸鼠作為獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，接種對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株后每周進(jìn)行裸鼠活體成像，8周后解剖取得肺，淋巴，脊柱，腦組織，并解剖出器官特異性轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移瘤，活體成像儀分析。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中的5只小鼠的肺，淋巴，脊柱，腦均發(fā)生了肺癌轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移百分比均為100%。而實(shí)驗(yàn)組L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM、L9981-BoM細(xì)胞株，均具有器官特異性轉(zhuǎn)移，但沒有發(fā)生其他器官轉(zhuǎn)移。L9981-LuM細(xì)胞株全部轉(zhuǎn)移到肺，5只裸鼠均發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移瘤，轉(zhuǎn)移百分比均為100%，而縱隔淋巴結(jié)，脊柱，大腦均沒有發(fā)生肺癌轉(zhuǎn)移。L9981-LnM細(xì)胞株全部轉(zhuǎn)移到縱隔淋巴結(jié)，5只裸鼠中均發(fā)生了縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而肺、脊柱和大腦均為發(fā)現(xiàn)有肺癌轉(zhuǎn)移。L9981-BrM細(xì)胞株全部轉(zhuǎn)移到大腦，5只裸鼠均發(fā)生了大腦轉(zhuǎn)移，而肺、淋巴結(jié)和骨均未發(fā)現(xiàn)有肺癌轉(zhuǎn)移。L9981-BoM細(xì)胞株接種裸鼠后5只裸鼠全部發(fā)生了脊柱轉(zhuǎn)移，而肺、淋巴結(jié)、和大腦均未發(fā)現(xiàn)肺癌轉(zhuǎn)移（圖2，表1）。

圖2 第一代原代器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移器官活體成像成像Fig 2 The living imaging of metastasized organs planted with the first generation of organ-specific metastasis lung cancer cell line

表 1 母系肺癌細(xì)胞株與4株器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株成瘤性及器官特異性轉(zhuǎn)移率比較Tab 1 comparison of tumorigenicity and organ-specific metastasis ability between the parent lung can cell line L9981 and the 4 organ-specific metastasis cell lines

2.2 器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)學(xué) 培養(yǎng)篩選所得人肺癌器官特異性轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株，分別通過100×、200×、40×顯微觀察其形態(tài)，與對(duì)照組細(xì)胞比較，形態(tài)均發(fā)生了不同程度的改變，其中L9981-BoM、L9981-BrM、L9981-LnM三株細(xì)胞株形態(tài)較之L9981-luc的不規(guī)則梭形均變化呈不同程度的圓形形態(tài)（圖3）。

2.3 人肺癌器官特異性轉(zhuǎn)移細(xì)胞株轉(zhuǎn)移裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移的活體成像結(jié)果 通過裸鼠腹股溝皮下種植篩選獲得的具有靶向器官特異性轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞，此后分別在1周、3周、6周活體成像分析其體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力，發(fā)現(xiàn)所檢測腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)普遍成瘤且發(fā)生了轉(zhuǎn)移，活體成像觀察的原位癌信號(hào)強(qiáng)弱與體內(nèi)生長時(shí)間呈正相關(guān)，體內(nèi)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)弱同樣與時(shí)間呈正相關(guān)（圖4）。

3 討論

肺癌轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標(biāo)志和的重要生物學(xué)特征，且是造成癌癥患者死亡的首要因素[2-6]。腫瘤的轉(zhuǎn)移是由多因素參與、多基因調(diào)控，腫瘤細(xì)胞與靶器官相互作用的多階段復(fù)雜過程[7-10]。每個(gè)組織、器官都有自身的結(jié)構(gòu)及微環(huán)境特點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞侵入靶器官就必須應(yīng)對(duì)環(huán)境的壓力，包括：氧氣和營養(yǎng)的缺乏、低pH、活性氧自由基和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，經(jīng)過環(huán)境的選擇后，腫瘤細(xì)胞形成新的癌灶[12-20]。

圖3 母系與器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株形態(tài)學(xué)比較Fig 3 Comparison of morphology among the parent lung cancer cells and the organ-specific metastasis cells

腫瘤器官轉(zhuǎn)移具有器官特異性的，不同類型腫瘤的轉(zhuǎn)移對(duì)不同靶器官的親和力往往不同，存在屬于其自身的特點(diǎn)。前列腺癌最最常見的轉(zhuǎn)移部位是骨，肝癌最常見的轉(zhuǎn)移器官為肺；乳腺癌常轉(zhuǎn)移到肺、骨和大腦；肺癌常轉(zhuǎn)移到大腦、淋巴結(jié)、骨、肝臟和腎上腺。目前，肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌引發(fā)高死亡率原因主要是因?yàn)榉伟┌l(fā)生了其它器官的轉(zhuǎn)移，比如腦、骨、脊柱、淋巴等。因此，深入研究肺癌器轉(zhuǎn)特異性轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理及信號(hào)調(diào)節(jié)途徑，極有可能為肺癌轉(zhuǎn)移的預(yù)測、早期診斷和開發(fā)抑制/或逆轉(zhuǎn)的分子靶向藥物具有重要的理論意義和廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而，要研究肺癌器官特異性轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的最可靠方法是必須應(yīng)用具有相同遺傳背景、不同器官特異性轉(zhuǎn)移的天然對(duì)比細(xì)胞株。正是基于上述科學(xué)問題，我們應(yīng)用我們實(shí)驗(yàn)室的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981為母系細(xì)胞株作研究材料，經(jīng)體內(nèi)外篩選，以期建立具有器官特異性轉(zhuǎn)移的肺癌細(xì)胞株。

圖4 器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株裸鼠活體成像Fig 4 The Living Imaging of the nude mice planted with organ-specific metastasis lung cancer cells

目前，國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種人器官特異性轉(zhuǎn)移惡性腫瘤細(xì)胞株[22-29]。但是，迄今為止有關(guān)肺癌器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株的篩選鑒定的研究國內(nèi)外均無報(bào)道。因此，本課題組應(yīng)用我們實(shí)驗(yàn)室建立的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株為材料，通過體內(nèi)外的篩選鑒定，成功篩選建立了一個(gè)能特異性轉(zhuǎn)移到肺、縱隔淋巴結(jié)、骨和大腦的器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞模型，并將特異性轉(zhuǎn)移到肺，淋巴，腦，脊柱的器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株，分別命名為L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM。隨后，我們應(yīng)用裸鼠肺癌自發(fā)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，活體成像技術(shù)和病理學(xué)技術(shù)對(duì)L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM的器官特異性轉(zhuǎn)移潛能進(jìn)行了驗(yàn)證。我們的研究結(jié)果證明：與母系肺癌細(xì)胞株L9981比較，L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM肺癌細(xì)胞株除均能在裸鼠體內(nèi)均成瘤外，還能特異性地轉(zhuǎn)移到肺、淋巴結(jié)、大腦和骨，而L998細(xì)胞株則除了能在裸鼠體內(nèi)成瘤外，還能百分之百地轉(zhuǎn)移到肺、淋巴結(jié)、大腦和骨。此外，通過顯微觀察，4株器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株（L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM）與母系細(xì)胞株L9981比較，其形態(tài)學(xué)發(fā)生了顯著改變，呈不規(guī)則圓形或橢圓型形態(tài)。我們推測，這一形態(tài)的變化可能是肺癌細(xì)胞在發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中，為了適應(yīng)轉(zhuǎn)移靶器官的微環(huán)境，并在靶器官形成新的癌灶，以便存活生長而發(fā)生的表型變化，但是其分子機(jī)制和細(xì)胞信號(hào)調(diào)控途徑尚未完全明了，有待以后進(jìn)行更深入的研究。