朱興春 劉青松 楊慧敏 方定志

（1四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 成都 610041；2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 南充 637000；3川北醫(yī)學(xué)院病理教研室 南充 637007）

末端結(jié)合蛋白1（EB1）在宮頸組織中的表達(dá)及其對(duì)自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

朱興春1，2劉青松2楊慧敏3方定志1△

（1四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 成都 610041；2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 南充 637000；3川北醫(yī)學(xué)院病理教研室 南充 637007）

目的探討末端結(jié)合蛋白1（end-binding protein 1，EB1）在宮頸組織中的表達(dá)及其對(duì)自噬標(biāo)志蛋白LC3和p62/SQSTM1蛋白表達(dá)的影響。方法免疫組織化學(xué)檢測(cè)EB1在宮頸癌、宮頸息肉和慢性宮頸炎組織中的表達(dá)；siRNA干擾方法抑制EB1基因表達(dá)，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法檢測(cè)此時(shí)宮頸癌Siha細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3和p62/SQSTM1基因的表達(dá)。結(jié)果EB1的表達(dá)部位主要集中在細(xì)胞核外周的胞質(zhì)中。EB1在宮頸癌和宮頸息肉中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于宮頸慢性炎性組織（P＜0.05），但在陽(yáng)性表達(dá)的宮頸癌組織中，絕大多數(shù)間質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為陰性；EB1在中、低分化宮頸鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于高分化宮頸鱗癌組織（P＜0.05）。當(dāng)EB1基因表達(dá)在宮頸癌Siha細(xì)胞中的表達(dá)被抑制時(shí)，無(wú)論是在mRNA還是在蛋白水平，自噬標(biāo)志蛋白p62/SQSTM1和LC3的表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）。結(jié)論EB1在自噬發(fā)生較低的宮頸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率低于自噬發(fā)生較高的宮頸慢性炎性組織；抑制EB1在宮頸癌Siha細(xì)胞中的表達(dá)，則自噬標(biāo)志蛋白p62/SQSTM1和LC3表達(dá)改變，這一發(fā)現(xiàn)充分證明EB1在宮頸癌的自噬過(guò)程中發(fā)揮著一定的生物學(xué)效應(yīng)。

末端結(jié)合蛋白1（EB1）；宮頸癌；自噬；自噬體；微管

宮頸癌在世界范圍內(nèi)都是婦女發(fā)病和致死的主要原因。雖已確認(rèn)人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是宮頸癌的主要病原體，然而僅僅是該病毒的感染不足以引起癌癥演變。宮頸癌同其他腫瘤［1］一樣，也具有非整倍體和染色體不穩(wěn)定現(xiàn)象［2］，但最新研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞的染色體非整倍體和染色體不穩(wěn)定與所感染的HPV類型無(wú)關(guān)［3］，這充分說(shuō)明宮頸癌的發(fā)病機(jī)制和其他腫瘤一樣復(fù)雜，因此有必要對(duì)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行探討。

自噬作為一種進(jìn)化保守的溶酶體降解途徑，是細(xì)胞質(zhì)中長(zhǎng)壽蛋白和細(xì)胞器降解的主要方式并通常在癌癥中下調(diào)［4］。自噬也因在癌癥發(fā)展過(guò)程中對(duì)非整倍體形成的重要作用［5-6］成為近幾年來(lái)腫瘤形成機(jī)制和治療的重要研究方向。研究表明，自噬的激活可降低肝細(xì)胞癌的基因組不穩(wěn)定性［7］。抑制上皮細(xì)胞中自噬必需基因BECN1和ATG5的表達(dá)可引起基因擴(kuò)增和非整倍體形成［8-9］。這些研究充分展示了自噬在腫瘤發(fā)展中非整倍體形成的作用，但具體機(jī)制還不清楚。

細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性和非整倍體產(chǎn)生的前提依賴微管的動(dòng)態(tài)不平衡［10］。微管末端結(jié)合蛋白1（endbinding protein 1，EB1）作為調(diào)節(jié)微管平衡的關(guān)鍵蛋白［11-12］，在高滲誘發(fā)的腎近端小管樣細(xì)胞LLC-PK1自噬時(shí)，與微管的結(jié)合頻率增加［13］。另外，抑制Hela細(xì)胞中EB1表達(dá)可促進(jìn)染色體分離錯(cuò)誤而導(dǎo)致非整倍體產(chǎn)生［14］。上述研究結(jié)果充分表明了EB1在自噬和非整倍體中的重要作用，但EB1在宮頸癌中的表達(dá)鮮有報(bào)道，且其在自噬中的具體機(jī)制還不清楚。為此，本研究檢測(cè)了宮頸癌組織中EB1的表達(dá)，并干擾宮頸癌細(xì)胞Siha中EB1的表達(dá)，以明確自噬標(biāo)志基因LC3和p62/SQSTM1的表達(dá)改變，初步探討EB1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展和自噬中的功能。

材料和方法

標(biāo)本收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院宮頸癌石蠟包埋組織121例，其中鱗癌112例，腺癌9例，年齡中位數(shù)為50（33～79）歲；另收集宮頸息肉石蠟包埋組織51例，宮頸炎癥石蠟包埋組織29例。每個(gè)組織4μm厚度切片，75℃烤片2h后備用。

宮頸癌Siha細(xì)胞株由四川大學(xué)華西第二臨床醫(yī)學(xué)院王和教授惠贈(zèng)。細(xì)胞接種到25mm2培養(yǎng)瓶中，加5mL含10％FBS的DMEM（GIBCO）培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞約80％融合后，用0.25％胰酶消化傳代，按1×105細(xì)胞復(fù)種于6孔板，37℃、5％CO2培養(yǎng)過(guò)夜。

免疫組織化學(xué)手術(shù)切除的標(biāo)本用100g/L甲醛固定，石蠟包埋，組織切片厚度4μm。免疫組化采用SP法，PBS代替EB1單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）作陰性對(duì)照。以上實(shí)驗(yàn)步驟按免疫組化試劑盒（北京嘉美生物）說(shuō)明書的程序進(jìn)行。EB1表達(dá)陽(yáng)性時(shí)呈棕黃色，主要分布于核周胞質(zhì)中，并按照染色深淺分組：陰性（-）：無(wú)染色；弱陽(yáng)性（+）：淺染色；陽(yáng)性（++）：中度染色；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：強(qiáng)染色。

RNAiEB1干擾片段由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和合成，EB1干擾片段：正義鏈：5′-GCU-GCGUAUUGUCAGUUUATT-3′，反義鏈：5′-UAAACUGACAAUACGCAGCTT-3′；FAM標(biāo)記陰性對(duì)照片段：正義鏈：5′-UUCUCCGAACGU-GUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。5×104細(xì)胞復(fù)種于6孔板，37℃、5％CO2培養(yǎng)過(guò)夜。去除原培養(yǎng)液，并用PBS洗2次，按照siRNA操作說(shuō)明，用無(wú)血清培養(yǎng)基配制100pmol的siRNA片段和250μL脂質(zhì)體2000，37℃、5％CO2培養(yǎng)6h后，熒光倒置顯微鏡下觀察并更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30h。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR以上6孔板細(xì)胞用PBS洗2次，加500μL Trizol，按說(shuō)明書程序提取總RNA。分光光度計(jì)對(duì)所提總RNA進(jìn)行定量和純度鑒定，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質(zhì)量。采用BioBRK Rever Tra Ace以隨機(jī)引物為引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green適時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)目的基因mRNA進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。EB1引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，上游引物：5′-GGATCAATGAGTCTCTGCAGTTG-A-3′，下游引物：5′-GGAGCCAGGGAACAGCAT-G-3′；LC3B引物購(gòu)自韓國(guó)Bioneer公司，上游引物：5′-AATCCCGGTGATCATCGAGC-3′，下游引物：5′-GCCGGATGATCTTGACCAAC-3′；p62/SQSTM1引物也購(gòu)自韓國(guó)Bioneer公司，引物號(hào)為8878，以βactin為內(nèi)對(duì)照（引物購(gòu)自上海生工），上游引物：5′-TCCCTGGAGAAGAGCTAC-GA-3′，下游引物：5′-AGCACTGTGTTGGCGT-ACAG-3′。反應(yīng)體系為20μL，取樣本cDNA 2μL、上游和下游引物各0.25μL，加入試劑盒其他成分。反應(yīng)條件如下：94℃10min 1個(gè)循環(huán)，94℃15s、60℃1min、40個(gè)循環(huán)，全程采集熒光。數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt表示。

Western blot6孔板細(xì)胞用PBS洗2次，0.25％胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗1遍后，加入50μL RIPA裂解液裂解細(xì)胞，10 080×g離心15min，上清液分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〉攘康鞍祝s30μg）經(jīng)15％的聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至0.2μm孔徑的PVDF膜，5％脫脂奶粉室溫封閉后，加入EB1（美國(guó)Santa Cruz公司）、LC3B或p62/SQSTM1（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），其中EB1以1∶200稀釋，后兩者均以1∶1 000稀釋，4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（均為1∶3 000），室溫孵育1h，洗膜后采用電化學(xué)發(fā)光顯影成像。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料（免疫組織化學(xué)陽(yáng)性率）采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布故以xˉ±s表示，兩組間均值比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

EB1在宮頸組織中的表達(dá)EB1主要在宮頸組織細(xì)胞核周胞質(zhì)中表達(dá)，隨著陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，甚至在胞核中也表現(xiàn)為陽(yáng)性（圖1）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，EB1在宮頸鱗癌、腺癌和息肉組織中的陽(yáng)性率分別為59.8％、55.6％和66.7％，顯著低于宮頸炎性組織的93.1％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。在絕大多數(shù)陽(yáng)性表達(dá)的宮頸癌組織中，雖然癌細(xì)胞表現(xiàn)為陽(yáng)性，但正常間質(zhì)細(xì)胞為陰性（圖2）。EB1在高分化宮頸鱗癌組織中陽(yáng)性率顯著高于中、低分化宮頸鱗癌組織（P＜0.05，表2）。

圖1 EB1在中分化宮頸鱗癌組織中的免疫組織化學(xué)結(jié)果（×400）Fig 1 Results of EB1 protein expressions in middle differentiation cervical squamous carcinoma tissues detected by immunohistochemical method（×400）

EB1被抑制時(shí)自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)本實(shí)驗(yàn)采用siRNA方法干擾EB1基因在宮頸癌Siha細(xì)胞中的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)轉(zhuǎn)染6h后，大于90％的細(xì)胞檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖3）。當(dāng)轉(zhuǎn)染36h時(shí)，無(wú)論是在mRNA水平還是在蛋白水平，EB1的表達(dá)均顯著低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4A、D）。此時(shí)，自噬標(biāo)志蛋白LC3和p62/SQSTM1在mRNA水平和蛋白水平均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4B-D）。

表1 EB1在宮頸組織中的表達(dá)Tab 1 The expressions of EB1 protein in cervical tissues （％）

圖2 宮頸癌陽(yáng)性表達(dá)時(shí)EB1在癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中的表現(xiàn)差異（×400）Fig 2 The difference of EB1 performed in cancer cells and interstitial cells when it was positively expressed in cervical cancers（×400）

表2 宮頸鱗癌EB1表達(dá)與病理分化關(guān)系Tab 2 The relationbetween EB1 expression and the pathological differentiation of cervical squamous carcinomas （％）

討論

多個(gè)研究采用免疫組織化學(xué)和高通量方法證實(shí)了EB1在多種癌癥組織中的陽(yáng)性率明顯高于正常組織［15-17］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)EB1在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率約為60％，與其他腫瘤基本相同［15］。因?yàn)閭惱韺W(xué)原因本研究沒(méi)有收集到正常宮頸組織作為對(duì)照，因此無(wú)法判斷宮頸癌組織和正常組織中EB1表達(dá)的高低，但我們發(fā)現(xiàn)在EB1陽(yáng)性的宮頸癌組織中，絕大多數(shù)正常間質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有被檢測(cè)到陽(yáng)性棕色顆粒，側(cè)面反映了宮頸癌組織中EB1表達(dá)可能高于正常宮頸組織。另外，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，EB1在宮頸息肉和宮頸癌這兩種增生性組織中的陽(yáng)性表達(dá)相當(dāng)，這很可能與EB1對(duì)β-catenin/TCF通路的調(diào)節(jié)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)［15，18］。本研究還發(fā)現(xiàn)，EB1在宮頸炎性組織中的陽(yáng)性率高達(dá)90％以上，明顯高于宮頸癌組織。顯然，單從EB1促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)功能不足以解釋這一現(xiàn)象。是否因?yàn)樵趯m頸癌組織中細(xì)胞自噬降低［19］，而在炎性組織中自噬增加［20-21］有關(guān)？EB1又在自噬過(guò)程中起到什么功能？

自噬可對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體、炎性小體、細(xì)胞因子和功能退化的細(xì)胞器（如線粒體）進(jìn)行隔離和降解［22］。自噬由膜囊隔離細(xì)胞組分（稱為吞噬泡）開(kāi)始，隔離膜融合而形成雙分子層膜囊泡而稱為自噬體［23］。接著自噬體朝溶酶體靶向運(yùn)動(dòng)，自噬體的外層膜與溶酶體/空泡融合，釋放單分子層的囊泡（自噬小體）到溶酶體/空泡而形成自噬溶酶體。最后，被隔離的內(nèi)容物和內(nèi)膜被溶酶體水解酶降解。最近研究表明，自噬需要微管的參與［13］。Zhu等［24］在研究中報(bào)道，自噬標(biāo)志蛋白LC3在宮頸鱗癌組織的表達(dá)增加，雖然同患者年齡、臨床分期、病理分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，但發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的腫瘤患者3年生存率明顯高于低表達(dá)患者。一般情況下，病理分化與預(yù)后呈正相關(guān)，本研究結(jié)果顯示，宮頸鱗癌的分化程度越高，EB1的陽(yáng)性率越高，這也暗示EB1具有促進(jìn)自噬發(fā)生的可能。

圖4 EB1、LC3和p62/SQSTM1mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果Fig 4 The levels of m RNA and protein of EB1，LC3 and p62/SQSTM1

為了證實(shí)這一假設(shè)和基于宮頸癌染色體異常類型與感染HPV病毒類型無(wú)關(guān)［3］的理論，在本研究中我們選取高危HPV16型的宮頸癌Siha細(xì)胞作為進(jìn)一步研究對(duì)象。通過(guò)RNAi方法抑制EB1在Siha細(xì)胞中的表達(dá)，并檢測(cè)此時(shí)自噬標(biāo)志蛋白LC3和p62/SQSTM1的表達(dá)［25］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有效抑制EB1表達(dá)時(shí)，LC3 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白均顯著增加。LC3之所以為自噬的標(biāo)志蛋白是因?yàn)樗芴禺愋該胶系阶允膳葜校?6-28］，而單純檢測(cè)LC3不足以判斷自噬是否發(fā)生，自噬體與溶酶體融合阻斷或抑制溶酶體介導(dǎo)的蛋白水解時(shí)LC3-Ⅱ生成也可增加［25］。因此我們還對(duì)另一種自噬標(biāo)志蛋白p62/SQSTM1進(jìn)行了檢測(cè)。p62/SQSTM1是自噬的底物［29］，也具有激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)（mammalian target of rapamycin，mTOR）途徑的作用［30，31］而抑制細(xì)胞自噬，因此也成為監(jiān)控自噬體與溶酶體融合和降解的分子標(biāo)志。我們發(fā)現(xiàn)在EB1表達(dá)受抑制時(shí)，p62/SQSTM1 mRNA和蛋白水平也都顯著增加。這些結(jié)果表明抑制EB1，很可能是因?yàn)镋B1對(duì)微管穩(wěn)定性維持和促使微管正端組裝［32］受阻而阻斷自噬體的運(yùn)輸以及隨后發(fā)生的與溶酶體融合和降解從而抑制自噬的發(fā)生，導(dǎo)致LC3和p62/SQSTM1兩者表達(dá)均增加。同樣也印證了高自噬發(fā)生的宮頸炎性組織中EB1表達(dá)增加的結(jié)果；高分化宮頸癌組織EB1表達(dá)增加還預(yù)示著自噬發(fā)生增加的可能性。

綜上所述，EB1在自噬發(fā)生較低的宮頸癌組織中的表達(dá)低于自噬發(fā)生較高的慢性宮頸炎性組織中的表達(dá)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道EB1在腫瘤組織較正常組織高表達(dá)和本研究中宮頸癌細(xì)胞陽(yáng)性的組織中間質(zhì)細(xì)胞為陰性表現(xiàn)，推斷EB1在染色體異常的宮頸癌組織中的表達(dá)可能高于正常組織。推測(cè)EB1的高表達(dá)具有維持染色體異常的癌癥組織的穩(wěn)定分裂而促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，而更高表達(dá)則可能誘發(fā)細(xì)胞自噬發(fā)生的可能。EB1在染色體分離和自噬過(guò)程中的雙重功能值得我們進(jìn)一步探索。

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The expression of end-binding protein 1（EB1）in cervical tissues and its effect on the expressions of autophagic biomarkers

ZHU Xing-chun1，2，LIU Qing-song2，YANG Hui-min3，F(xiàn)ANG Ding-zhi1△
（1Department of Btochemtstry and Molecular Btology Laboratory，West Chtna College of Bastc and Forenstc Medtctne，Stchuan Untverstty，Chengdu610041，Stchuan Provtnce，Chtna；2Department of Laboratory Medtctne，Afftltated Hospttal of Northern Stchuan Medtcal College，Nanchong637000，Stchuan Provtnce，Chtna；3Department ofPathology，Northern Stchuan Medtcal College，Nanchong637007，Stchuan Provtnce，Chtna）

ObjectiveTo investigate the expression of end-binding protein 1（EB1）in cervical tissues and its effect to the expressions of autophagic biomarkers，LC3 and p62/SQSTM1.MethodsThe expression of EB1 protein in cervical carcinoma，cervical polyps and chronic cervicitis tissues was detected by mmunohistochemical method.The expression of EB1 in cervical cancer Siha cells was knocked down by siRNA，and then the expressions of autophagic biomarkers，LC3 and p62/SQSTM1 were detected by realtime fluorescent quantitative PCR and Western blot.ResultsThe EB1 mainly located on the cytoplasm which embraces peripheral of nucleus.The positive expression rate of EB1 in cervical cancer and cervical polyps tissues was significantly lower than those in cervical tissues of chronic inflammation（P＜0.05），butthe vast majority of interstitial cells were negatively expressed of EB1 in the EB1 positive expression cervical cancer tissues.The positive expression rate of EB1 in middle and low differentiation cervical squamous cell carcinoma tissues was significantly lower than that of high differentiation squamous cell carcinoma tissues（P＜0.05）.When the expression of EB1 was knocked down in cervical cancer Siha cells by siRNA，the expression of autophagic biomarkers，p62/SQSTM1 and LC3，were significantly increased at both mRNA level and protein level（P＜0.05）.ConclusionsEB1 in cervical cancer tissues whose autophagy is suppressed is lower expressed than in cervical chronic inflammation tissues whose autophagy is activated.Both p62/SQSTM1 and LC3，the autophagic biomarkers，are dramatically increased in cervical cancer Siha cells when the EB1 expression was suppressed，which indicates EB1 plays a role in autophagy of cervical carcinoma.

end-binding protein 1（EB1）；cervical cancer；autophagy；autophagosome；microtubule

R 737.33

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.05.012

△Corresponding author E-mail：dzfang@scu.edu.cn

2013-11-29；編輯：沈玲）