陳孫霞 王曉慶 徐曉恩 姜英華 劉 鋒△

（1復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系 上海 200433）

共培養(yǎng)體系中高紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記結(jié)腸癌細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)

陳孫霞1，2王曉慶1，2徐曉恩1姜英華1劉 鋒1△

（1復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系 上海 200433）

目的提高mCherry紅色熒光蛋白（red fluorescence protein，RFP）在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而可以通過(guò)檢測(cè)共培養(yǎng)體系中細(xì)胞的熒光值來(lái)分析結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，以利于結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境的研究。方法用293FT細(xì)胞制備pBMN-mCherry病毒液。利用多次感染（1～4次）的方法提高RFP在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、Lo Vo、SW620及HCT116中的表達(dá)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到不同感染次數(shù)細(xì)胞RFP標(biāo)記的陽(yáng)性率，并將高陽(yáng)性表達(dá)RFP的結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的熒光值與細(xì)胞數(shù)量關(guān)系進(jìn)行比較，分析評(píng)價(jià)兩者的線(xiàn)性關(guān)系。結(jié)果通過(guò)優(yōu)化，熒光標(biāo)記效率大幅度提高。結(jié)腸癌腫瘤成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)中，熒光值與細(xì)胞數(shù)量線(xiàn)性關(guān)系R2＞0.9；該方法成功用于檢測(cè)共培養(yǎng)體系中單種細(xì)胞增殖。結(jié)論在結(jié)腸癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞熒光值來(lái)分析。

紅色熒光蛋白（RFP）；共培養(yǎng)；細(xì)胞增殖；結(jié)腸癌

*This work was supported by the Chinese National Key Program on Basic Research（973）（2011CB910702，2013CB911201）.

腫瘤的生長(zhǎng)不僅與惡性腫瘤細(xì)胞有關(guān)，也與腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)。在實(shí)體腫瘤組織中，除了腫瘤細(xì)胞本身外，腫瘤微環(huán)境中還包含成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及胞外基質(zhì)等［1-2］。而成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最主要的基質(zhì)細(xì)胞。血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRα）［3］及波形蛋白（vimentin，VIM）是成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物［4］，而平滑肌肌動(dòng)蛋白α（alphasmooth muscle actin，α-SMA）則是成纖維細(xì)胞活化的標(biāo)志［5］。結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)在引起死亡的腫瘤中位居第三［6］。對(duì)結(jié)腸癌微環(huán)境的研究逐漸成為熱點(diǎn)。

將基質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，是研究腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展影響的重要手段［7］。近年來(lái)，細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)日趨多樣化。體外共培養(yǎng)技術(shù)包括接觸或者非接觸。接觸培養(yǎng)包括二維（two dimentional，2D）培養(yǎng)或者模擬腫瘤體內(nèi)微環(huán)境的三維（three dimentional，3D）培養(yǎng)技術(shù)。其中2D培養(yǎng)技術(shù)是將一種細(xì)胞接種在另一種細(xì)胞之上或者將兩種細(xì)胞混合后接種。這種培養(yǎng)方法可以檢測(cè)細(xì)胞的增殖、細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化以及細(xì)胞遷移等。該類(lèi)方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)于研究早期的腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞相互作用具有很大意義。例如Li等［8］將骨髓基質(zhì)細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行2D共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)u-PA和MMP2促進(jìn)自組裝網(wǎng)絡(luò)的形成，與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移有關(guān)。Xu等［9］用微流控芯片3D共培養(yǎng)技術(shù)對(duì)肺癌細(xì)胞藥物敏感性進(jìn)行了研究。

腫瘤細(xì)胞的增殖是檢測(cè)腫瘤微環(huán)境的重要指標(biāo)之一［10］。在本研究中，我們優(yōu)化了成纖維細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系中細(xì)胞增殖情況的檢測(cè)方法。我們選擇性地用紅色熒光蛋白（red fluorescence protein，RFP）標(biāo)記結(jié)腸癌細(xì)胞［11］，以利用熒光吸收值檢測(cè)細(xì)胞增殖情況［12］；利用多次標(biāo)記技術(shù)大幅度提高熒光標(biāo)記效率，同時(shí)采用整體熒光檢測(cè)的方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖。優(yōu)化后的方法縮短了檢測(cè)時(shí)間、提高了檢測(cè)通量，使檢測(cè)更加簡(jiǎn)易可行，減少了原代成纖維細(xì)胞的消耗及研究成本。這種方法的應(yīng)用也使得早期的腫瘤體外研究體系更簡(jiǎn)單。

材料和方法

主要實(shí)驗(yàn)儀器多功能酶標(biāo)儀Synergy H4（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；熒光倒置顯微鏡DP70（日本奧林巴斯有限公司）。

材料和試劑結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620、Lo Vo和HCT116（中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)），HT29細(xì)胞系（復(fù)旦大學(xué)上海市公共衛(wèi)生臨床中心張麗軍博士惠贈(zèng)）；感受態(tài)DH5α（北京天根生化科技有限公司）；96 well Assay Plate Black Plate（普通96孔板）和96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates（Corning，3340，以下簡(jiǎn)稱(chēng)96孔黑板）。其他試劑包括：轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司）；Opti-MEM和McCoy′s 5A Medium（美國(guó)Gibco公司）；RPMI 1640、DMEM/F12、DMEM/F12（無(wú)酚紅）、DMEM（High glucose）和Fetal bovine serum（FBS）（美國(guó)HyClone公司）；中抽試劑盒NucleoBond Xtra Midi（德國(guó)MACHERY-NAGEL公司）；4′，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Alexa Fluor-488-labeled兔抗IgG（美國(guó)Invitrogen公司）。

細(xì)胞培養(yǎng)Lo Vo細(xì)胞用RPMI 1640/10％FBS培養(yǎng)，SW620用DMEM/10％FBS培養(yǎng)，HT29、HCT116細(xì)胞用McCoy′s 5A培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）/10％FBS培養(yǎng)。所有的培養(yǎng)基中加入1％青霉素/鏈霉素（美國(guó)Hyclone公司），細(xì)胞放置在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

質(zhì)粒pBMN-mCherry及pCL10A的擴(kuò)增p BMN-mCherry，質(zhì)粒及逆轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒p CL10A（由本實(shí)驗(yàn)室保存）；取1～5ng p BMN-mCherry及p CL10A質(zhì)粒DNA分別加入到50μL的感受態(tài)DH5a中，混勻后置于冰上30min，42℃熱激后加入LB培養(yǎng)基，于37℃搖床內(nèi)孵育。待細(xì)菌增殖至菌液D600為0.5～0.8時(shí)，按照NucleoBond Xtra Midi說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA質(zhì)量D260/280為1.7～1.9。

p BMN-mCherry病毒液制作及感染將生長(zhǎng)良好的293FT細(xì)胞（1×106）傳代到10cm培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染前24h換成無(wú)雙抗的培養(yǎng)基。將pBMN-mCherry和pCL10A兩種質(zhì)粒各10μg混合到500μL OPTI-MEM中。將8μL Lipofectamine 2000加到500μL OPTI-MEM中，然后將兩種溶液混合均勻后靜置20min，加入到293FT細(xì)胞中。48h后，收取病毒上清，1 000×g離心10min后用0.45μm濾膜過(guò)濾。將病毒上清滴加到HT29、SW620、Lo Vo和HCT116細(xì)胞中。為提高標(biāo)記效率，我們采取多次感染的方法，每24h更換感染病毒液，重復(fù)感染1～3次，并用Olympus IX51熒光顯微鏡觀(guān)察及流式細(xì)胞儀檢查、評(píng)估標(biāo)記效率。

Western blot檢測(cè)待指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞生長(zhǎng)至90％融合度時(shí)，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗滌2次，加入SDS裂解液，提取蛋白，根據(jù)BCA法定量蛋白濃度；配置10％分離膠及5％濃縮膠后對(duì)蛋白進(jìn)行上樣；接著進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，最后進(jìn)行抗體免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光。

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖將1 500個(gè)生長(zhǎng)良好的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)皿中，在37℃、5％CO2孵箱中孵育；每天取出1個(gè)96孔板加10％CCK-8溶液，37℃繼續(xù)孵育1.5h后，在450nm處測(cè)定吸光度（D）值，根據(jù)D值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，隔天檢測(cè)3天。

原代成纖維細(xì)胞的分離、消化和培養(yǎng)經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院結(jié)腸癌手術(shù)切除的新鮮癌旁組織（與腫瘤組織間隔＞5cm）和腫瘤組織于無(wú)菌D-hanks溶液中保存。在超凈工作臺(tái)中，將新鮮組織用75％乙醇漂洗兩次，在無(wú)菌D-hanks液中漂洗2次，用鑷子仔細(xì)去除壞死組織和血塊。用眼科手術(shù)剪將組織盡可能剪成小塊，視組織大小加3倍體積膠原酶溶液（200μ/mL，Sigma）37℃水浴消化，待消化溶液變黏稠，加胰酶于37℃繼續(xù)消化3～5min。將細(xì)胞懸液過(guò)100μm的細(xì)胞篩網(wǎng)（BD Falcon）后收集，800×g離心5min。沉淀用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌1遍，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，待細(xì)胞密度80％～90％時(shí)傳代。

細(xì)胞免疫熒光將生長(zhǎng)狀態(tài)的成纖細(xì)胞種植在48孔板內(nèi)的細(xì)胞免疫熒光爬片上，置于7℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗3次后先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，PBS洗3次后再用通透液孵育30min。PBS洗去通透液，用5％BSA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1h。細(xì)胞核染色用4′，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）染色1min，最后用熒光倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光拍照。

成纖維細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)采取細(xì)胞混合培養(yǎng)方法，檢測(cè)結(jié)腸癌相關(guān)成纖維細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞的共培養(yǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。將單層培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和熒光標(biāo)記后的結(jié)腸癌細(xì)胞分別消化，按比例直接混合后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中（96孔黑板），單獨(dú)培養(yǎng)的熒光標(biāo)記腫瘤細(xì)胞作為對(duì)照。

共培養(yǎng)熒光細(xì)胞的計(jì)數(shù)檢測(cè)將轉(zhuǎn)染1～4次病毒液的細(xì)胞按相同的體積及條件消化后，加入1mL PBS，取2mL過(guò)細(xì)胞篩網(wǎng)后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其陽(yáng)性標(biāo)記率。對(duì)照為未標(biāo)記細(xì)胞。

共培養(yǎng)細(xì)胞熒光信號(hào)的整體檢測(cè)將不同數(shù)量的細(xì)胞種植在普通96孔板或96孔黑板中，用多功能酶標(biāo)儀Synergy H4檢測(cè)不同細(xì)胞數(shù)對(duì)應(yīng)的熒光值。在共培養(yǎng)體系中，將成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)于96孔黑板中，分別檢測(cè)熒光值。檢測(cè)時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)驗(yàn)調(diào)整，激發(fā)光為587nm，發(fā)射光為610nm，狹長(zhǎng)設(shè)置為10nm；溫度為37℃，掃描采用Area scan法或者Top read法。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)照組成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)與實(shí)驗(yàn)組成纖維與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞生長(zhǎng)差異采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用t檢驗(yàn)，差異顯著性檢驗(yàn)水平設(shè)為雙尾0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

p BMN-mCherry病毒液感染標(biāo)記結(jié)腸癌細(xì)胞用pBMN-mCherry病毒液，分別感染結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、SW620、Lo Vo及HCT116以進(jìn)行熒光蛋白標(biāo)記。在p BMN-mCherry首次標(biāo)記后，熒光信號(hào)比較低，顯微鏡視野中大多數(shù)為未標(biāo)記的細(xì)胞（圖1A）。如果進(jìn)行再次標(biāo)記，RFP標(biāo)記效率有所提高（圖1B）。而在感染第4次時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞的標(biāo)記效率大幅提高，顯微鏡視野下幾乎大部分的細(xì)胞均為RFP標(biāo)記細(xì)胞（圖1C）。這些結(jié)果提示，多次標(biāo)記可以提高pBMN-mCherry病毒液的感染效率。

圖1 重復(fù)感染pBMN-mCherry病毒提高結(jié)腸癌細(xì)胞的標(biāo)記效率（×200）Fig 1 Repeated infection with pBMN-mCherry virus increases labeling efficiency of colon cancer cell lines（×200）

熒光標(biāo)記效率的檢測(cè)我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同標(biāo)記次數(shù)的結(jié)腸癌細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記率，同時(shí)檢測(cè)標(biāo)記效率是否能夠隨著感染次數(shù)增多而持續(xù)增高。檢測(cè)結(jié)果表明，隨著pBMN-mCherry病毒液感染次數(shù)增加，細(xì)胞的RFP標(biāo)記率明顯提高，在HCT116和HT29細(xì)胞中甚至接近100％（圖2）。圖2下為細(xì)胞用p BMN-mCherry病毒液感染5次后的陽(yáng)性標(biāo)記率，我們發(fā)現(xiàn)第5次感染對(duì)于進(jìn)一步提高細(xì)胞的標(biāo)記效率幾乎沒(méi)有效果。這些結(jié)果表明，p BMN-mCherry病毒液感染以上4種結(jié)腸癌細(xì)胞，經(jīng)過(guò)4次標(biāo)記即可達(dá)到較高的RFP標(biāo)記率［13］。我們對(duì)高標(biāo)記的細(xì)胞多次傳代，間隔2個(gè)月后對(duì)高標(biāo)記率的HT29細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示細(xì)胞的陽(yáng)性標(biāo)記率幾乎沒(méi)有改變（圖2B）。生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析表明多次標(biāo)記對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響（圖2C）。細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯變化（圖2D）。

熒光信號(hào)與細(xì)胞增殖的關(guān)系檢測(cè)共培養(yǎng)體系中的單種細(xì)胞通常使用流式細(xì)胞儀，但耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞需求量大，對(duì)細(xì)胞標(biāo)記率要求高。

在本研究中，為監(jiān)測(cè)共培養(yǎng)體系中結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖狀態(tài)，我們檢測(cè)共培養(yǎng)體系中的整體熒光值，對(duì)不同給定數(shù)量的熒光細(xì)胞的熒光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。我們采用兩種96孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和檢測(cè)。結(jié)果表明普通96孔板熒光值與細(xì)胞數(shù)量之間未呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，而96孔黑板的熒光檢測(cè)值與細(xì)胞數(shù)量呈線(xiàn)性關(guān)系，結(jié)果較穩(wěn)定（圖3A）。對(duì)于酶標(biāo)儀的讀取方法，選用面積掃描0.99（圖3C）讀取的熒光值與細(xì)胞量的線(xiàn)性關(guān)系優(yōu)于點(diǎn)讀取0.98（圖3D）。圖3B中，對(duì)于低標(biāo)記的細(xì)胞（m1HT29代表HT29細(xì)胞經(jīng)過(guò)一次標(biāo)記）其細(xì)胞的熒光數(shù)值增長(zhǎng)十分緩慢，不能客觀(guān)地代表細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。而高標(biāo)記的細(xì)胞（m4 HT29代表HT29細(xì)胞經(jīng)過(guò)4次標(biāo)記）中，細(xì)胞的增殖數(shù)值偏向正常值（圖3）。

采用上述綜合方法，可以得到熒光值與細(xì)胞的線(xiàn)性關(guān)系為0.9924，并且將m4 HT29與結(jié)腸癌正常成纖維細(xì)胞混合共培養(yǎng)后，其線(xiàn)性關(guān)系也可達(dá)到0.99（圖3D、E）。以上結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)體系中，可以用細(xì)胞整體熒光值檢測(cè)單種細(xì)胞的增殖量。

原代結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞的鑒定我們從新鮮結(jié)腸癌組織及癌旁組織中分離出一對(duì)成纖維細(xì)胞，正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞（normal fibroblasts，NFs）來(lái)自于癌旁正常組織，結(jié)腸癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）來(lái)自于結(jié)腸癌腫瘤組織。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示NFs及CAFs的a-SMA及Vimentin（VIM）染色結(jié)果為完全陽(yáng)性（圖4A），而上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin免疫熒光顯示為完全陰性（數(shù)據(jù)未展示）。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物a-SMA，Vimentin及PDGFRa在成纖維細(xì)胞均有表達(dá)（圖4B）。

圖2 紅色熒光蛋白陽(yáng)性率及高標(biāo)記熒光細(xì)胞的生物學(xué)特征Fig 2 Detection of RFP labeling rate by flow cytometer and the biological characteristics of high labeling cells

結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞對(duì)HT29細(xì)胞增殖的影響將成纖維細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞1∶1混合后共培養(yǎng)，第7天的檢測(cè)結(jié)果表明，正常成纖維細(xì)胞（CC-0426NF，P=0.014）及腫瘤成纖維細(xì)胞（CC-0426TAF，P=0.007）顯著抑制共培養(yǎng)中結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的增殖（圖5）。在1∶2的比例混合共培養(yǎng)中，正常成纖維細(xì)胞CC-0426NF對(duì)HT29細(xì)胞的增殖起到了顯著的抑制作用（P＜0.01，n=5）。所以我們可以初步判斷體外共培養(yǎng)體系中，正常結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞對(duì)HT29細(xì)胞的增殖起到了抑制作用，而腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞對(duì)HT29的作用則有待于我們進(jìn)一步研究。

圖3 熒光值與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系Fig 3 The relationship between cell count and fluorescence value

圖4 原代結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物的檢測(cè)Fig 4 The expression of common fibroblast protein markers in the primary fibroblasts

圖5 結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞對(duì)HT29細(xì)胞增殖的影響Fig 5 The influence of colon fibroblasts on HT29 cells

討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用及影響，近年來(lái)逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。由于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，腫瘤微環(huán)境一直是研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。過(guò)去的十多年中已經(jīng)認(rèn)同了腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤發(fā)生及發(fā)展有著顯著的影響，腫瘤與微環(huán)境之間的“Crosstalk”很大程度上影響著腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力［14-15］。腫瘤細(xì)胞的增殖是檢測(cè)腫瘤微環(huán)境的重要指標(biāo)之一［15］。我們將腫瘤細(xì)胞進(jìn)行熒光蛋白標(biāo)記，通過(guò)檢測(cè)共培養(yǎng)中的熒光信號(hào)，分析腫瘤細(xì)胞的增殖情況。提高檢測(cè)效率的關(guān)鍵是提高標(biāo)記效率。本實(shí)驗(yàn)利用多次感染的方法來(lái)提高pBMN-mCherry對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的標(biāo)記效率，且這種標(biāo)記效率能保持至少一個(gè)月以上的穩(wěn)定期，該檢測(cè)結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道一致［13］，且在生物學(xué)特性上沒(méi)有明顯改變。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)4次感染，RFP標(biāo)記效率達(dá)到最高值，HCT116及HT29細(xì)胞的標(biāo)記率均從首次標(biāo)記的31％和36％分別提高到96％和99％，SW620及Lo Vo細(xì)胞則達(dá)到60％～70％。高效標(biāo)記省去流式細(xì)胞儀篩選富集的步驟，提高了熒光檢測(cè)效率。

共培養(yǎng)方法包括傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)方法及近幾年的熱點(diǎn)3D培養(yǎng)［16］。但是由于3D培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜并且價(jià)錢(qián)相對(duì)昂貴，對(duì)于腫瘤微環(huán)境共培養(yǎng)體系的初步研究中我們?nèi)匀贿x擇2D法進(jìn)行研究。2D共培養(yǎng)包括非接觸及接觸式培養(yǎng)。前者利用Transwell平板共培養(yǎng)，一般采用錐蟲(chóng)藍(lán)計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖［17］。后者檢測(cè)細(xì)胞增殖一般采用流式細(xì)胞儀法統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量［18］，但其價(jià)格高、操作繁瑣，不便于通量檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用高標(biāo)記的細(xì)胞監(jiān)測(cè)共培養(yǎng)體系中單種細(xì)胞的增殖。首先，需要對(duì)細(xì)胞的熒光值與細(xì)胞數(shù)量的線(xiàn)性關(guān)系進(jìn)行研究［19］，我們利用Synergy H4對(duì)HT29不同的細(xì)胞量（0～4×104），進(jìn)行了熒光值檢測(cè)。高標(biāo)記的熒光值不僅與細(xì)胞數(shù)量呈線(xiàn)性關(guān)系（＞0.99），數(shù)值的絕對(duì)值也與真實(shí)的細(xì)胞數(shù)量增速接近，而低熒光標(biāo)記的細(xì)胞兩項(xiàng)表現(xiàn)都較差。所以，細(xì)胞的熒光標(biāo)記率達(dá)到一定的值，熒光值可以很好地代表細(xì)胞的增殖速度，熒光標(biāo)記率越高越好。其次，我們需要驗(yàn)證共培養(yǎng)體系中這種熒光值代表單種細(xì)胞增殖的關(guān)系是否仍然存在。因此我們選擇了正常的結(jié)腸癌細(xì)胞與m4 HT29細(xì)胞進(jìn)行直接接觸的混合培養(yǎng)，結(jié)果顯示RFP在610nm的讀數(shù)與共培養(yǎng)中細(xì)胞的數(shù)量呈線(xiàn)性關(guān)系（R=0.9974）。提示該方法可以用于早期2D共培養(yǎng)體系中單種細(xì)胞增殖的檢測(cè)，簡(jiǎn)便了共培養(yǎng)體系的檢測(cè)方法。

高熒光標(biāo)記的細(xì)胞不僅可應(yīng)用于共培養(yǎng)體系細(xì)胞增殖檢測(cè)，也可用于該體系中的細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察［20-21］，例如在3D培養(yǎng)體系中可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)變化［22］，還可用于小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究等［23］。

最后，我們運(yùn)用該方法將m4 HT29與一對(duì)結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞0426NF/TAF進(jìn)行了共培養(yǎng)。并用上述方法檢測(cè)共培養(yǎng)體系與單培養(yǎng)體系中HT29細(xì)胞的增殖量。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們看到在HT29與0426NF 1∶1或1∶2時(shí)，正常成纖維細(xì)胞顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而在與0426TAF的共培養(yǎng)中由于成纖維細(xì)胞與HT29的比例不同，則出現(xiàn)了不同的結(jié)果，該結(jié)果與Sadlonova等［24］的報(bào)道一致。關(guān)于這項(xiàng)研究還有待深入探討。

綜上所述，高RFP標(biāo)記的細(xì)胞可以應(yīng)用于接觸式的2D共培養(yǎng)體系中單種細(xì)胞增殖情況的檢測(cè)。這一方法的應(yīng)用，簡(jiǎn)化了對(duì)早期共培養(yǎng)體系中腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的基質(zhì)細(xì)胞相互作用的研究，也為我們后續(xù)的研究提供了基礎(chǔ)及方向。

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The technology of detecting high red fluorescence protein（RFP）labeled colon cancer cells in a co-culture system

CHEN Sun-xia1，2，WANG Xiao-qing1，2，XU Xiao-en1，JIANG Ying-hua1，LIU Feng1△
（1Instttute of Btomedtcal Sctences，F(xiàn)udan Untverstty，Shanghat200032，Chtna；2Department of Chemtstry，F(xiàn)udan Untverstty，Shanghat200433，Chtna）

ObjectiveTo improve the expression efficiency of the mCherry red fluorescence protein（RFP）in colorectal cancer cells.So that the proliferation of colon cancer cells in the co-culture system can be easily monitored by measuring the fluorescence signals，which is suitable for colorectal cancer microenvironment analysis.Methods293FT cells were used to produce the pBMN-mCherry virus，which was used to infect the colon cancer cell lines HT29，Lo Vo，SW620 and HCT116.The labeling procedure was repeated up to four times to improve the labeling efficiency of the RFP.The positively labeled cells of each round labeling were detected by flow cytometer.The fluorescence value of HT29 with highly labeled RFP was compared with its cell count and the linear relationship between both values was evaluated.ResultsAfter optimization，the fluorescence labeling efficiency was greatly improved.A linear coefficient correlation of R2＞0.9 was achieved between the florescence value andthe cell count when analyzing the proliferation of colon cancer cells in the co-cultured system.ConclusionsIn a co-culture system of colon cancer cells and fibroblasts，the proliferation of colon cancer cells can be measured by detecting their fluorescence signals.

red fluorescence protein（RFP）；co-culture；cell proliferation；colorectal cancer

R 735.3+5

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.05.006

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2011CB910702，2013CB911201）

△Corresponding author E-mail：liuf@fudan.edu.cn

2014-01-17；編輯：王蔚）