費 騰 李 朔 潘建峰 劉 嘉 陳 晨 郭常安 邵云潮 閻作勤

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科 上海 200032）

局部植入利福平（RFP）緩釋劑對P糖蛋白（P-gp）活性及激素性股骨頭壞死的影響

費 騰 李 朔 潘建峰 劉 嘉 陳 晨 郭常安 邵云潮 閻作勤△

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科 上海 200032）

目的觀察局部植入利福平（rifampicin，RFP）緩釋劑對P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）活性及激素性股骨頭壞死的影響。方法建立激素性股骨頭壞死的動物模型，取32只成年雌性兔，隨機平均分為4組：3個對照組（空白/口服給藥/肌肉注射）和局部緩釋組（試驗組）。其中局部緩釋組于左側(cè)股骨上段植入RFP緩釋劑，右側(cè)相同位置植入空白顆粒作為對照。4周后檢測外周血、骨髓內(nèi)單核細胞P-gp活性，肝內(nèi)細胞色素P450（cytochrom P450，CYP450）含量，比較骨代謝血清學(xué)指標、組織學(xué)形態(tài)（HE、Masson染色）、股骨頭壞死率。結(jié)果局部緩釋組左側(cè)骨髓內(nèi)P-gp活性高于右側(cè)（P＜0.05）?？诜?、肌注組外周血P-gp活性和肝細胞色素P4503A含量高于局部緩釋組（P＜0.05）。HE染色示：局部緩釋組左側(cè)股骨頭比右側(cè)骨小梁增寬，脂肪細胞減少，骨壞死率降低（P＜0.05）；口服、肌注組股骨頭骨質(zhì)流失及脂肪化受到抑制。Massons染色示：口服、肌注及局部緩釋組左側(cè)股骨頭骨質(zhì)成熟膠原較多，礦化完全。結(jié)論局部植入RFP對外周P-gp及肝內(nèi)CYP450無明顯影響，可增強骨內(nèi)P-gp活性，降低激素性骨壞死發(fā)生率。

激素性股骨頭壞死；P糖蛋白（P-gp）；細胞色素P450（CYP450）；利福平（RFP）

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（81371966，81171671）.

股骨頭壞死按病因可分創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩大類。激素在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中占首位病因［1］。同樣激素劑量和作用時間，僅部分人出現(xiàn)骨壞死，說明個體對激素的敏感性存在差異。P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和細胞色素p450（cytochrome P450，CYP450）是影響激素在體內(nèi)代謝與蓄積的主要因子，有文獻報道其功能活性與激素性骨壞死的易感性密切相關(guān)［2-3］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，利福平（rifampicin，RFP）作為P-gp誘導(dǎo)劑，可上調(diào)外周血單核細胞P-gp活性，降低激素性股骨頭壞死率［4］。但全身給藥的方法令機體產(chǎn)生激素耐藥，減弱激素的治療作用。而且RFP同時誘導(dǎo)肝臟CYP450酶，CYP450與P-gp存在藥物代謝上的協(xié)作關(guān)系［5］，無法探明單純上調(diào)P-gp活性對激素性骨壞死的預(yù)防價值。本研究以局部植入的方式，設(shè)立全身給藥組作為對照，觀察RFP對股骨頭局部及外周血P-gp活性、肝臟CYP450含量的影響，明確局部上調(diào)P-gp活性在預(yù)防激素性骨壞死中的價值。

材料和方法

實驗設(shè)計32只成年雌性日本大耳白兔（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動物實驗中心）平均分為4組：空白對照；口服RFP（10mg·kg-1·d-1）；肌肉注射RFP（10mg·kg-1·d-1）；局部緩釋組（股骨第3轉(zhuǎn)子后下方約0.5cm處鉆出直徑約3～4mm的圓形缺損，左側(cè)骨髓腔內(nèi)植入RFP人工骨顆粒，右側(cè)植入空白顆粒，每側(cè)植入4粒，骨蠟封閉缺損，逐層縫合傷口）。1周后所有動物一次性肌注射甲強龍（20mg/kg），建立激素性骨壞死模型［6］，3周后處死動物予以相關(guān)檢測。

RFP緩釋顆粒的制備硫酸鈣人工骨具有釋放藥物速率穩(wěn)定、吸收完全的優(yōu)點［7］。徐華梓等［8］發(fā)現(xiàn)，RFP硫酸鈣植入體內(nèi)后緩釋時間可持續(xù)45天以上，且釋放濃度（0.55μg/mL）仍高于最小抑菌濃度（0.018μg/mL），全身血藥濃度一直保持較低水平。將0.5g RFP與硫酸鈣人工骨（OSTEOSET，Wright Medical Technology Inc）5g混合，加入混合液，攪拌約30s后涂抹在模具內(nèi)，固化3～5min，倒出顆粒置于400mg/L環(huán)氧乙烷中，常壓下滅菌2h，4℃避光保存待用（圖1）。每側(cè)植入4粒，日均RFP釋放量為0.5g×4/28天=0.07g/天。

圖1 RFP-硫酸鈣緩釋顆粒Fig 1 Extended release particles of RFP calcium sulfate

P-gp活性檢測處死動物前取股骨上段骨髓及外周血2mL，分別緩慢加入等體積Percoll分離液中，保持兩者間清晰的界面，900×g離心20min后吸取中間白膜細胞層為所需細胞。PBS洗滌3次后加入羅丹明123濃度為2μg/mL的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育10min。200×g離心10min洗滌后將細胞加入普通DMEM培養(yǎng)基中，再次孵育60min，200×g離心10min后重懸。流式細胞儀測定熒光強度，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為525nm。以未經(jīng)過羅丹明123染色的細胞作為對照。細胞表面P-gp活性與其向胞外泵出羅丹明123的速率成正比，胞內(nèi)殘留熒光強度越小、P-gp活性越高。

肝臟CYP450含量檢測處死動物，取小塊肝組織剪碎，Tris-HCl緩沖液洗2次，每克組織加3mL Tris-HCl，冰浴中手工勻漿。4℃下10 000×g離心20min后取上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管內(nèi)，4℃下105 000×g離心60min，棄上清，沉淀物即為肝微粒體。按每克肝臟組織制成的微粒體加1mL Tris-HCl進行懸浮，ELISA法測定CYP450含量。

骨代謝血清學(xué)指標檢測取外周血8mL，900×g離心20min，取上層清夜，ELISA法（大白兔ELISA試劑盒，美國Abcam公司）測定骨鈣素、堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶濃度。

組織學(xué)檢測股骨頭常規(guī)固定、脫鈣，HE染色，光學(xué)顯微鏡（×100）下隨機取5個視野，計數(shù)脂肪細胞數(shù)量、最大脂肪細胞直徑、空骨陷窩率。Image Pro Plus 6.0軟件測量平均骨小梁寬度、間距以及骨小梁面積百分比。以空骨陷窩率均大于50％為標準，統(tǒng)計股骨頭壞死率。Masson染色觀察骨組織成熟及新骨形成。

統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計分析。采用t檢驗和單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

局部植入RFP對P-gp活性及CYP450含量的影響如表1和圖2所示：口服、肌注組外周血單核細胞P-gp活性及肝臟CYP450含量明顯高于空白對照及局部緩釋組（P＜0.001）；局部緩釋組左側(cè)股骨頭內(nèi)骨髓單核細胞平均熒光強度為292.0±105.1低于右側(cè)的698.2±226.8，植入RFP增強了這一側(cè)骨髓內(nèi)單核細胞P-gp的活性（P=0.003），但對外周P-gp及肝臟CYP450無顯著影響。

圖2 細胞內(nèi)殘存羅丹明123熒光強度峰值曲線Fig 2 Fluorescence curve of intracellular rhodamine 123

表1 外周P-gp活性及肝臟CYP450含量Tab 1 Activity of peripheral P-gp and content of hepatic CYP4503A （±s）

表1 外周P-gp活性及肝臟CYP450含量Tab 1 Activity of peripheral P-gp and content of hepatic CYP4503A （±s）

Index Control Oral IntramuscularImplantation P-gp 905±207 267±117 361±147 943±507 CYP450（pmol/L）500±60 703±94 638±63 478±73

局部上調(diào)P-gp活性對股骨頭的病理學(xué)及血清學(xué)的影響如圖3（HE染色）、表2和表3所示：與空白對照組相比，口服、肌注及局部緩釋組左側(cè)股骨頭軟骨下區(qū)骨小梁寬度增寬，面積增大，脂肪細胞數(shù)量減少，直徑減小，空骨陷窩減少，股骨頭壞死率降低。局部緩釋組右側(cè)與空白對照組股骨頭軟骨下區(qū)組織學(xué)差別不明顯。相對空白對照組，口服、肌注組血清骨鈣素含量升高（P=0.008；P=0.007），口服組抗酒石酸酸性磷酸酶濃度下降（P=0.03）、堿性磷酸酶血清濃度升高（P=0.007）。局部緩釋組血清學(xué)指標無明顯變化。

圖3 股骨頭的HE染色結(jié)果（×40）Fig 3 HE staining of femoral head（×40）

表2 成骨和破骨活性的血清學(xué)檢測結(jié)果Tab 2 Serological indicators of osteogenic and osteoclastic activity （±s）

表2 成骨和破骨活性的血清學(xué)檢測結(jié)果Tab 2 Serological indicators of osteogenic and osteoclastic activity （±s）

BGP：Bone gla protein；TRAP：Tarate-resistant acid phosphatase；AKP：Alkaline phosphatase.

Group Control Oral Intramuscular Implantation BGP（ng/L）10.40± 0.92 11.71± 0.89 11.74± 0.86 10.34± 0.68 TRAP（pg/L）2 394± 294 1 954± 368 2 381± 423 2 429± 320 AKP（pg/mL）48.76± 4.65 69.0± 16.86 51.47± 3.03 53.72± 4.02

表3 骨小梁分析數(shù)據(jù)Tab 3 Data analysis of trabecular bone （±s）

表3 骨小梁分析數(shù)據(jù)Tab 3 Data analysis of trabecular bone （±s）

Data Control Oral Intramuscular Implantation（left）Implantation（right）Fat vacude No.98.4±34.5 55.9±23.9 42.2±17.6 67.7±20.1 118.6±40.6 Diameter of lipocyte（μm）47.4±8.1 42.8±8.2 39.3±8.5 40.6±9.7 44.7±7.6 Percent trabecular area（％）28.4±10.1 47.4±9.8 40.9±9.4 41.5±8.1 28.3±8.6 Trabecular separation（μm）230.1±40.6 192.5±36.2 191.6±36.9 178.6±35.6 225.9±37.3 Trabecular width（μm）177.5±34.4 223.9±51.3 219.1±48.7 230.8±34.6 183.6±31.9 Osteonecrosis ratio（％）37.5 12.5 10 20 30

局部上調(diào)P-gp活性對股骨頭新骨形成的影響如圖4所示（Masson染色）：空白對照組及局部緩釋組右側(cè)股骨頭藍染區(qū)域較多，表明未成熟膠原增加，骨質(zhì)正常形成、修復(fù)過程受到影響?？诜⒓∽⒁约熬植烤忈尳M左側(cè)股骨頭骨小梁內(nèi)見較多紅染的成熟骨組織，礦化完全。

圖4 股骨頭的Masson染色結(jié)果（×40）Fig 4 Masson staining of femoral head（×40）

討論

激素性骨壞死的發(fā)病機制尚未明確，個體間基因多態(tài)性與激素性骨壞死易感性之間的關(guān)系成為近年研究的熱點，包括凝血相關(guān)、脂代謝相關(guān)、微血管損傷相關(guān)基因多態(tài)性等。與藥物代謝相關(guān)的MDR1、CYP450酶等基因多態(tài)性被證實與個體對包括激素在內(nèi)的藥物的敏感性存在關(guān)聯(lián)［9］。Asano等［10］發(fā)現(xiàn)，P-gp活性較高的MDR1-C3435TT基因型個體具有較低的激素性骨壞死發(fā)生率。Tokuhara等［2］發(fā)現(xiàn)，CYP450活性降低時，激素性股骨頭壞死發(fā)生率增高，說明激素代謝排出能力較強的基因型個體，激素性骨壞死的易感性下降。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)：RFP體外增強骨髓間充質(zhì)干細胞P-gp活性，抑制激素對間充質(zhì)干細胞的成脂分化作用；體內(nèi)應(yīng)用RFP可增強血液單核細胞P-gp活性，降低激素性股骨頭壞死率［4］。但RFP亦可上調(diào)肝臟CYP450酶表達，于全身水平加快激素代謝排出。本實驗中，局部植入RFP緩釋劑的方法避開了對外周激素代謝的影響，僅在局部發(fā)揮預(yù)防激素性骨壞死的作用。

RFP緩釋劑局部上調(diào)P-gp活性，對外周P-gp、CYP4503A無顯著影響RFP對P-gp活性的上調(diào)作用多報道于針對腫瘤、藥物耐藥方面的研究，且多位于胃腸道、肝臟等P-gp較豐富的部位，為全身作用［11-12］，對于局部骨內(nèi)P-gp的影響未見報道。體內(nèi)植入人工骨藥物載體增加局部藥物濃度的方法已被廣泛應(yīng)用，可避免全身用藥帶來的不良反應(yīng)［7-8］。采取此方法令RFP上調(diào)局部P-gp活性，使骨內(nèi)局部對激素耐藥，不加快激素在外周組織的代謝排出。

間充質(zhì)干細胞（mesenchyal stem cells，MSCs）具有多項分化潛能，其成骨、成脂分化的能力與激素性骨壞死的發(fā)生相關(guān)，且易從體內(nèi)分離檢測，我們前期對MSCs表面P-gp活性分別進行體外誘導(dǎo)和抑制，發(fā)現(xiàn)P-gp活性升高可抑制激素引起的MSCs成脂分化與凋亡，促進成骨分化［4］，因此以MSCs作為反映局部骨內(nèi)P-gp活性的細胞。局部緩釋組左右兩側(cè)骨內(nèi)的P-gp活性的配對t檢驗顯示，局部植入RFP可明顯上調(diào)該側(cè)骨內(nèi)P-gp活性，但8只動物的基礎(chǔ)P-gp活性檢測結(jié)果有較大差別，而且個體間兩側(cè)骨內(nèi)P-gp活性的差距不一，說明P-gp的基礎(chǔ)活性水平及其對RFP的敏感性在個體間均存在變異。

P-gp與CYP450有多種共同的誘導(dǎo)劑，包括R、苯巴比妥、地塞米松等，誘導(dǎo)劑與細胞孕甾烷X受體結(jié)合調(diào)節(jié)CYP3A和P-gp基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而誘導(dǎo)CYP3A和P-gp活性與表達增加［13-14］。本實驗中口服與肌注RFP均誘導(dǎo)了外周P-gp和肝臟CYP450升高，兩種給藥方式的區(qū)別在于口服給藥的肝臟首過效應(yīng)，RFP首先作用于肝臟，誘導(dǎo)CYP450升高，而經(jīng)肝臟入血的代謝產(chǎn)物仍有誘導(dǎo)P-gp的作用。肌肉注射雖避免了肝臟首過效應(yīng)，但RFP主要通過膽道和腸道排泄，可通過肝腸循環(huán)再次入肝誘導(dǎo)肝臟CYP450的表達活性。相比全身給藥，局部緩釋的方法由于RFP入血濃度較低，將其對P-gp的誘導(dǎo)作用局限在骨內(nèi)，避免對肝臟及外周組織產(chǎn)生影響。

局部上調(diào)P-gp活性抑制激素性骨壞死發(fā)生HE染色切片示：口服、肌注、局部植入緩釋RFP均可令股骨頭組織鏡下呈現(xiàn)骨小梁面積增大、排列規(guī)則，脂肪空泡減少、空骨陷窩率降低等特點?？诜⒓∽⒔M的骨質(zhì)流失及骨壞死率低于局部緩釋組，說明全身用RFP誘導(dǎo)機體對激素耐藥的作用較強，降低了其對股骨頭的損傷效應(yīng)。而局部給藥促進股骨頭組織細胞內(nèi)激素的排出，減弱了激素對該側(cè)股骨頭的作用，但不如全身給藥作用顯著。另外，局部緩釋組同一個體兩側(cè)股骨頭壞死程度不一的結(jié)果說明，激素對局部骨組織的直接作用可能是骨壞死發(fā)病發(fā)展過程中的主導(dǎo)因素，凝血、脂質(zhì)代謝異常等全身性改變可能僅是激素性骨壞死過程中的伴隨表現(xiàn)，而并非根本原因。

本實驗未直接對成骨細胞、破骨細胞的P-gp活性及其功能進行分離檢測，并且體內(nèi)直接檢測股骨頭局部激素蓄積程度難度較大，因此在后續(xù)的體外細胞實驗中會對上述問題進行進一步驗證。

局部上調(diào)P-gp活性促進激素性骨壞死后的重建修復(fù)體內(nèi)骨組織一直在經(jīng)歷周期性骨重建過程。正常情況下，只有骨形成與骨吸收達到動態(tài)平衡，才能維持總體骨量的穩(wěn)定。而這種平衡受到多個環(huán)節(jié)的影響，包括骨祖細胞的分化方向、成骨細胞分泌類骨質(zhì)的堆積、類骨質(zhì)礦化、破骨細胞對骨質(zhì)的吸收等［15］。Siler等［16］認為股骨頭壞死發(fā)病期間經(jīng)歷一個共同的骨質(zhì)疏松的病理過程，鏡下表現(xiàn)為骨組織總量減少。本研究Masson染色示：對照組及局部緩釋組右側(cè)股骨頭骨成熟膠原含量下降，HE染色切片上的骨小梁面積、間距、寬度數(shù)據(jù)均表明，激素使骨質(zhì)正常的更新代謝受到影響，抑制機體對已壞死骨組織的修復(fù)重建，導(dǎo)致未成熟類骨質(zhì)增多，礦化不全。在RFP作用組中，股骨頭下區(qū)Masson染色紅染區(qū)占優(yōu)勢，成熟膠原增多，礦化完全，骨小梁寬度、面積增大，從骨質(zhì)和骨量兩方面說明了上調(diào)局部激素代謝對股骨頭的保護作用。表明股骨頭在受到一過性大劑量激素的沖擊后，P-gp對激素的清除作用在后續(xù)的骨修復(fù)過程中得以持續(xù)體現(xiàn)，降低激素對骨轉(zhuǎn)換過程的影響，促進類骨質(zhì)的礦化成熟。

綜上所述，局部植入RFP對外周P-gp及肝臟CYP450無明顯影響，可增強骨內(nèi)P-gp活性，降低激素性骨壞死發(fā)生率。由于激素性骨壞死多在大劑量激素沖擊治療后發(fā)生，對于患有腎炎、移植、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等基礎(chǔ)疾病的患者，降低激素對股骨頭局部的損害，同時保留激素在外周組織的治療作用就具有重要意義。但激素性骨壞死的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種因子的參與，更詳細的分子機制還需進一步研究。

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Effects of local sustained-release rifampicin（RFP）implantation on P-glycoprotein（P-gp）activity and steroid-induced osteonecrosis of femoral head

FEI Teng，LI Shuo，PAN Jian-feng，LIU Jia，CHEN Chen，GUO Chang-an，SHAO Yun-chao，YAN Zuo-qin△
（Department of Orthopedtcs，Zhongshan Hospttal，F(xiàn)udan Untverstty，Shanghat200032，Chtna）

ObjectiveTo study the effects of local implantation of sustained-release rifampicin（RFP）on P-glycoprotein（P-gp）activity and steroid-induced osteonecrosis of femoral head.MethodsThe animal model for steriod-induced oseteonecrosis of femoral head was established using 32 femal rabbits，which were equally divided into 4 groups：3 control groups（blank/oral/intramuscular injection group）and locally sustained release group（experimental group）.Experimental group were treated with RFPimplantation in femoral head（left side only），meanwhile blank particle was implanted on the right side.Activity of peripheral and bone marrow P-gp，content of hepatic cytochrom P450（CYP450）were observed 4 weeks later，as well as serological indicators on osteogenic and osteoclastic activity.Histological result and osteonecrosis rate were analyzed from HE staining and Masson staining of femoral head.ResultsIn experimental group，activity of bone marrow P-gp in the left femoral head was significantly increased compared with the right side（P＜0.05）.Peripheral P-gp activity and the content of hepatic CYP450 were more up-regulated in both oral and intramuscular injection groups than that in the expenimental group（P＜0.05）.According to HE staining，the left femoral head had/showed wider bone trabecula，less fat cells and lower osteonecrosis rate compared with the right side in experimental group，and thedeossification and pimelosis of femoral head were suppressed in oral and intramuscular injection groups.According to Masson staining，the left femoral head had more mature bone and was totallymineralization compared with the right side in oral，intramuscular injection and experimental groups.ConclusionsLocal implantation of RFPincreased P-gp activity in femoral head，but had no significant effect on peripheral P-gp or hepatic CYP4503A，and incidence of steroid-induced oseteonecrosis of femoral head was inhibited.

steroid-induced oseteonecrosis of femoral head；P-glycoprotein（P-gp）；cytochrome P450（CYP450）；rifampicin（RFP）

R 681.8

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.05.002

（81371966，81171671）

△Corresponding author E-mail：yan1002@hotmail.com

2014-01-28；編輯：段佳）