劉利敏，李繼坤

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院 普外科，上海，200080)

胃癌是目前中國第4位常見惡性腫瘤，新確診的惡性腫瘤病例中8%為胃惡性腫瘤[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)參與胚胎發(fā)育、組織重建和腫瘤轉(zhuǎn)移，本研究通過檢測胃癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中參與EMT的有關(guān)蛋白E-cadherin、Snail及Twist的表達(dá)，分析及其與臨床病理特征、預(yù)后情況等的相關(guān)性，探討EMT與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系及其在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2005年12月—2010年7月在上海市第一人民醫(yī)院普外科行標(biāo)準(zhǔn)胃癌根治術(shù)(D2)的80例患者為研究對象。其中男62例，女18例；確診時年齡45～83歲，中位年齡63歲；Lauren分型：腸型48例，彌漫型32例。所有患者術(shù)前各項檢查及術(shù)中未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)前未行新輔助放、化療。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集：選取胃癌原發(fā)癌灶組織、癌旁正常胃黏膜組織(距腫瘤切緣5cm以上)、胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及正常淋巴結(jié)。

1.2.2 檢測方法：所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，3 μm切片，常規(guī)脫蠟及水化，進(jìn)行免疫組化染色，方法選用EnVision法。之后的操作按SP試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，一抗(鼠抗人單克隆抗體E-cadherin(M0536)、山羊抗人Snail(ab53519)多克隆抗體、兔抗人Twist(ab50581)多克隆抗體皆購自英國Abcam公司)工作濃度為：E-cadherin(1∶100)，Snail(1∶200)，Twist(1∶200)。PBS代替一抗作為空白對照；以已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察患者胃癌術(shù)后生存情況；觀察E-cadherin、Snail和Twist蛋白在胃癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)情況；分析胃癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中E-cadherin、Snail、Twist蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

1.4 評價標(biāo)準(zhǔn)

用雙盲法對染色結(jié)果進(jìn)行評估。E-cadherin表達(dá)于胞膜或胞質(zhì)，呈黃色染色為陽性細(xì)胞，Twist蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于胞核，呈清晰的棕色或棕褐色為陽性細(xì)胞。每例切片隨機(jī)選取10個高倍視野，以陽性細(xì)胞的百分比進(jìn)行結(jié)果判定。E-cadherin：陽性細(xì)胞百分比≥25%為陽性；Twist：陽性細(xì)胞百分比≥5%為陽性。

Snail染色以胞核或/和胞漿出現(xiàn)淡黃色至棕黃色為陽性細(xì)胞。細(xì)胞按染色強度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比綜合計分作半定量分析。染色強度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性計分，與背景著色相對比，0分：無染色；1分：弱陽性；2分：陽性；3分：強陽性。按著色細(xì)胞百分比，1分：1%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%。然后按陽性細(xì)胞×染色強弱計積分，積分1～2為陰性，積分3～12為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 E-cadherin、Snail、Twist蛋白的表達(dá)

E-cadherin表達(dá)主要位于胞膜或胞漿內(nèi)，在癌旁正常胃黏膜組織中陽性表達(dá)率為100%(80/80)，原發(fā)灶中為37.50%(30/80)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中為63.75%(51/80)；Snail主要在細(xì)胞胞漿內(nèi)或胞核表達(dá)，在正常胃黏膜組織內(nèi)陽性表達(dá)率為30.00%(24/80)，胃癌組織中為71.25%(57/80)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中為53.75%(43/80)；Twist蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于胞核，呈清晰的棕色或棕褐色，在正常胃黏膜組織中陽性表達(dá)率為10.00%(8/80)，胃癌組織中為73.75%(59/80)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中為68.75%(55/80)。

胃癌原發(fā)灶與癌旁正常胃黏膜組織中三種蛋白的陽性表達(dá)率均有顯著差異(P<0.01)；胃癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中E-cadherin蛋白和Snail蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Twist蛋白的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。

2.2 胃癌原發(fā)灶中E-cadherin、Snail、Twist蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系

胃癌原發(fā)灶中E-cadherin的表達(dá)下調(diào)、Snail的過度表達(dá)與組織學(xué)類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期有關(guān)(P<0.05)，Twist過度表達(dá)與組織學(xué)類型、浸潤深度無關(guān)(P>0.05)，三種蛋白的表達(dá)均與性別、年齡、腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)，見表1。

2.3 E-cadherin、Snail、Twist蛋白的表達(dá)對胃癌術(shù)后生存情況的影響

E-cadherin表達(dá)的患者預(yù)后顯著好于不表達(dá)的患者(圖1)，而Snail、Twist陽性表達(dá)的患者與陰性患者相比，預(yù)后較差、生存率較低(圖2、圖3)。

總體生存率的多因素分析顯示，E-cadherin的表達(dá)情況、組織學(xué)分類、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為影響胃癌患者預(yù)后的獨立因素(P=0.018，P=0.012，P=0.025)，見表2。

表1 胃癌組織中E-cadherin、Snail、Twist蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系[n(%)]

表2 總體生存率的多因素分析

圖1 E-cadherin陽性/陰性患者生存曲線

圖2 Snail陽性/陰性患者生存曲線

圖3 Twist陽性/陰性患者生存曲線

3 討 論

近年來，隨著診斷技術(shù)的提高和內(nèi)鏡的推廣，胃癌的早期診斷率逐步提高，但標(biāo)準(zhǔn)胃癌根治手術(shù)(D2)仍然是目前唯一有望治愈胃癌的方法。研究表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是影響胃癌患者預(yù)后的最重要的因素之一[2]，即使是早期胃癌，如果伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比更容易復(fù)發(fā)，預(yù)后更差[3]。但是目前作者對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制還不明確。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象，其參與胚胎發(fā)育、組織重建和腫瘤轉(zhuǎn)移，上皮細(xì)胞表型的缺失及間質(zhì)特性的獲得是其主要特征。E-cadherin蛋白是上皮表型的重要標(biāo)志，E-cadherin蛋白功能喪失被認(rèn)為是EMT發(fā)生的一個重要標(biāo)志，多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移均與E-cadherin表達(dá)減弱有關(guān)[4]。

研究顯示[5]，在胃癌原發(fā)灶組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中E-cadherin蛋白的表達(dá)較正常胃黏膜組織中明顯降低。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胰腺癌中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin的低表達(dá)可能會促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[6-7]。E-cadherin蛋白的表達(dá)與腫瘤浸潤深度呈負(fù)相關(guān)，存在浸潤越深，病理分期越晚，E-cadherin蛋白陽性表達(dá)則相應(yīng)下降，提示在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)了上皮細(xì)胞表型的缺失，且這種缺失與腫瘤的侵襲能力相一致。此外，研究結(jié)果顯示伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明E-cadherin的缺失對于胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移具有重要意義。多因素分析也表明E-cadherin的表達(dá)情況、組織學(xué)分類、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為影響胃癌患者預(yù)后的獨立因素(P=0.018，P=0.012，P=0.025)，與本研究結(jié)果一致。

Snail、Twist均為EMT發(fā)生過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。有研究表明在胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中Snail、Twist蛋白的轉(zhuǎn)換較為頻繁，這可能是因為由EMT產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中能夠更頻繁的篩選出具侵襲性的細(xì)胞群[8]，提示可能根據(jù)這幾種蛋白的表達(dá)情況，來判斷胃癌原發(fā)灶的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。Shin等[9-10]發(fā)現(xiàn)胃癌患者EMT相關(guān)蛋白Snail的過度表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并提示預(yù)后不良。Markiewicz等[11-13]在乳腺癌中以EMT相關(guān)標(biāo)志物判斷腫瘤原發(fā)灶的侵襲性，發(fā)現(xiàn)E-cadherin、Snail、Twist蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另有研究[14-16]發(fā)現(xiàn)彌漫型胃癌Snail與E-cadherin蛋白下調(diào)及腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，表達(dá)陽性提示患者的預(yù)后不良。本研究發(fā)現(xiàn)Snail蛋白在胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平有顯著差異(P<0.05)，且Snail、Twist蛋白陽性表達(dá)的患者較陰性表達(dá)患者，其預(yù)后相對較差，但多因素分析結(jié)果提示Snail、Twist蛋白均不是影響胃癌患者預(yù)后的獨立因素。

綜上所述，E-cadherin蛋白的表達(dá)情況、組織學(xué)分類、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為影響胃癌患者預(yù)后的獨立因素，E-cadherin蛋白表達(dá)的患者較不表達(dá)的患者表現(xiàn)出更好的預(yù)后。

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