黃穎琦, 孫蘇平, 任 敏, 單 哲, 韓文敏

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院, 1.放療科; 3.血液科;2.江蘇大學(xué)附屬常州市武進(jìn)人民醫(yī)院 血液科, 江蘇 常州, 213002)

凋亡相關(guān)蛋白因子(Fas，又稱(chēng)Apo-1或CD95)為Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量為48 kD，屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)受體超家族成員，以可溶性(sFas)或膜分子(mFas)形式存在。FasL又名CD178，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，屬于TNF配體超家族成員，F(xiàn)asL是TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體，可特異性結(jié)合Fas，為Fas的天然配體。Fas/FasL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制是人體細(xì)胞自身新陳代謝進(jìn)程中一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其表達(dá)異常或功能缺陷所致的凋亡路徑障礙，對(duì)腫瘤的形成和維持具有重要病理生理意義[1]。Fas/FasL系統(tǒng)的異常不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也與免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病等密切聯(lián)系。本研究分析了惡性血液病患者外周血中血清sFas、FasL的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年10月—2014年3月經(jīng)組織學(xué)檢查確診的惡性血液病患者26例為觀察組，9例來(lái)自常州市武進(jìn)人民醫(yī)院血液科住院患者，17例來(lái)自常州市第二人民醫(yī)院血液科住院患者。所有患者初治無(wú)感染癥狀，且均符合診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[2]；其中男20例，女12例；年齡23～83歲，中位年齡57歲；其中急性髓系白血病(AML)4例，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)8例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)14例。另選取同期在常州市武進(jìn)人民醫(yī)院體檢中心體檢的20例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男、女各10例；年齡29～75歲，中位年齡55歲。2組性別、年齡、心、肝腎功能等一般資料無(wú)顯著差異，具有可比性。

1.2 治療方案

ALL患者6例予VDLP(長(zhǎng)春新堿+潑尼松+柔紅霉素+門(mén)冬酰胺酶)方案，2例予VDP(長(zhǎng)春新堿+柔紅霉素+強(qiáng)的松)方案化療；NHLⅠ期和Ⅲ期患者均予CHOP(環(huán)磷酰胺+阿霉素+長(zhǎng)春新堿+強(qiáng)的松)方案化療，NHLⅡ期患者4例予CHOP方案, 3例予R-CHOP(美羅華+CHOP)方案化療。AML患者2例予IA(去甲氧柔紅霉素+阿糖胞苷)方案，2例予HA(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷)方案化療。每3周為1周期，每例化療2個(gè)周期。

1.3 標(biāo)本采集

患者化療前與第2周期化療結(jié)束后14 d抽取靜脈血2 mL，不做抗凝處理，血液凝固后離心分離血清, -80 ℃保存。對(duì)照組血清同樣方法處理并保存。

1.4 血清Fas、FasL水平測(cè)定

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA，美國(guó)BD公司)檢測(cè)血清sFas、FasL水平，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad680型)讀取吸光度值。

1.5 療效評(píng)定

按血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[2]分為：完全緩解(CR)，部分緩解(PR)，未緩解(NR)，CR+PR為有效，NR為無(wú)效。

2 結(jié) 果

2.1 化療前各組血清Fas、FasL水平

化療前，ALL、NHL患者血清sFas、FasL水平較對(duì)照組高(P<0.05)，AML患者血清sFas、FasL水平與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05), 見(jiàn)表1。

表1 觀察組化療前與對(duì)照組血清Fas、FasL水平比較±s) μg/L

表2 化療前后ALL組CR患者sFas、FasL水平比較±s) μg/L

表3 NHL組患者不同病理分期sFas、FasL水平比較±s) μg/L

2.2 ALL組化療前后血清sFas、FasL水平變化

ALL、AML患者年齡、性別、FAB分型、免疫分型及有無(wú)浸潤(rùn)癥狀(包括胸骨壓痛、淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大)等各指標(biāo)之間，血清sFas、FasL水平均無(wú)顯著性差異(P>0.05)?；?周期后，5例初治ALL完全緩解(CR)患者sFas、FasL水平下降，見(jiàn)表2。因AML組化療后CR及NR例數(shù)少，未作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2.3 NHL組化療前后血清sFas、FasL水平變化

NHL組患者的年齡、性別、病理分型及有無(wú)B組癥狀(發(fā)熱、盜汗、6個(gè)月內(nèi)體重下降1/10或更多)等各指標(biāo)之間，血清sFas、FasL水平差異無(wú)顯著性(P>0.05), 但NHL不同臨床分期之間sFas、FasL水平差異顯著(P<0.05或P<0.01), 見(jiàn)表3?；熀驝R、PR組差異顯著(P<0.05), NR組則無(wú)顯著性差異(P>0.05), 見(jiàn)表4。

表4 NHL患者不同療效治療前后sFas、FasL水平比較±s) μg/L

3 討 論

增殖、分化、凋亡是細(xì)胞的三大特征，在維持正常組織的生長(zhǎng)平衡過(guò)程中三者相互調(diào)節(jié)，共同發(fā)揮作用。在惡性腫瘤的病理機(jī)制研究中，長(zhǎng)期以來(lái)人們側(cè)重于腫瘤增殖活性和分化特征方面的研究，但對(duì)細(xì)胞凋亡的研究甚少。然而越來(lái)越多的研究表明細(xì)胞凋亡異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因。細(xì)胞凋亡，又稱(chēng)程序性死亡，是一種為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細(xì)胞自殺過(guò)程，受到遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控。作為維持機(jī)體自身穩(wěn)定的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)胞凋亡逐漸受到人們的重視。

Fas/FasL系統(tǒng)是體內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要蛋白分子[3]，當(dāng)FasL結(jié)合到細(xì)胞表面的Fas分子后，配體化的Fas通過(guò)其死亡結(jié)構(gòu)域與銜接蛋白(FADD)肽鏈C端的死亡結(jié)構(gòu)域交連，從而募集胞漿中的FADD。FADD的肽鏈N端含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，可以集聚細(xì)胞凋亡蛋白酶-8酶原，從而使其集聚到Fas受體，形成凋亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)，導(dǎo)致凋亡蛋白酶-8活化并將凋亡信號(hào)向下傳遞，最終活化Caspase-3。Caspase-3為細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵效應(yīng)酶，其活化最終導(dǎo)致該Fas陽(yáng)性細(xì)胞凋亡[4]，此機(jī)制在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有顯著意義。

Casado-Zapico等[5]發(fā)現(xiàn)在AML中，褪黑素通過(guò)增加Fas/FasL的表達(dá)誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。另一項(xiàng)研究表明，在肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中Fas表達(dá)降低，當(dāng)Fas蛋白表達(dá)水平低于一定閾值后，無(wú)法被天然配體FasL識(shí)別，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中表達(dá)FasL的免疫細(xì)胞無(wú)法識(shí)別此種腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞不發(fā)生凋亡而繼續(xù)存活并增殖[6]。研究表明Fas/FasL系統(tǒng)的異常與惡性血液病發(fā)病亦有一定的關(guān)聯(lián)[7-10]。因此，F(xiàn)as及FasL蛋白異常表達(dá)使腫瘤細(xì)胞凋亡異常，可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。

sFas游離存在于血液等細(xì)胞外液中，它是Fas基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程中丟失了一部分堿基而形成的，sFas與膜Fas競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FasL，從而減少由Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，是腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的一個(gè)機(jī)制[11]。多數(shù)研究[12-14]顯示在惡性腫瘤時(shí)，sFas升高。本研究結(jié)果顯示，血清sFas水平在ALL、NHL患者中均較正常人升高，而與患者的年齡、性別、病理分型等臨床資料無(wú)關(guān)。ALL患者化療完全緩解時(shí)，sFas水平下降。隨著NHL的病情發(fā)展，sFas水平升高。這些結(jié)果提示sFas對(duì)惡性血液病的診斷有一定意義，并可作為療效判定的一個(gè)有效指標(biāo)[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，正常人sFas、FasL水平一致，而不同血液病(如AML)或不同疾病狀態(tài)下(如NHL)sFas表達(dá)的差異較大，對(duì)這些不同表達(dá)的含義及sFas與其他相關(guān)凋亡蛋白的關(guān)系需進(jìn)一步闡明。且在ALL、NHL的發(fā)病中，到底是何種機(jī)制增加了Fas基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程中丟失，治療有效過(guò)程中又有何種機(jī)制減少其丟失，還需要有更多更廣泛的科學(xué)研究來(lái)進(jìn)一步闡明。

[1] Silva K L, Melo L M, Perosso J, et al.CD95 (FAS) and CD178 (FASL) induce the apoptosis of CD4+and CD8+cells isolated from the peripheral blood and spleen of dogs naturally infected with Leishmania spp[J].Vet Parasitol, 2013, 197(3/4): 470.

[2] 張之楠, 沈娣.血液病及診斷療效標(biāo)準(zhǔn)[M].3版.北京: 科學(xué)出版社, 2007, 8: 131.

[3] 許學(xué)文, 宋彥, 由凱, 等.進(jìn)展性前列腺癌中Fas和Survivin的表達(dá)及其相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2009, 17(1): 71.

[4] He P, Zhou G, Qu D, et al.HBx inhibits proliferation and induces apoptosis via Fas/FasL upregulation in rat renal tubular epithelial cells[J].J Nephrol, 2013, 26(6): 1033.

[5] Casado-Zapico S, Martin V, Garcia-Santos G, et al.Regulation of the expression of death receptors and their ligands by melatonin in haematological cancer cell lines and in leukaemia cells from patients[J].J Pineal Res, 2011, 50(3): 345.

[6] Wong R S.Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment[J].J Exp Clin Cancer Res, 2011, 30(1): 87.

[7] Tawara M, Maeda T, Yamada Y, et al.Aberrant processing of Fas transcripts in adult T-cell leukemia: a possible role in tumor cell survival[J].Cancer Lett, 2003, 193(2): 235.

[8] Liu J H, Wei S, Lamy T, et al.Blockade of Fas-depend apoptosis by soluble Fas in LGL leukemia[J].Blood, 2002, 100(4): 1449.

[9] Jones C L, Wain E M, Chu C C, et al.Downregulation of Fas gene expression in Szary syndr ome is associated with promoter hypermethylation[J].J Invest Dermatol, 2010, 130(4): 1116.

[10] Wu J, Nihal M, Siddiqui J, et al.Low FAS/CD95 Expression by CTCL correlates with reduced sensitivity to apoptosis that can be restored by Fas upregulation[J].J Invest Dermatol, 2009, 129(5): 1165.

[11] Chang W T, Hsieh B S, Cheng H L, et al.Progesterone augments epirubicin-induced apoptosis in HA22T/VGH cells by increasing oxidative stress and upregulating Fas/FasL[J].J Surg Res, 2014, 188(2): 432.

[12] 湯華, 樊春鳳, 劉澤法, 等.惡性血液病患者醫(yī)院感染臨床分析[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2012, 16(1): 105.

[13] 余正平, 丁家華, 陳寶安, 等.不同供者來(lái)源異基因造血干細(xì)胞移植治療惡性血液病69例療效和預(yù)后分析[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2012, 32(11): 862.

[14] 李娟, 劉俊茹, 陳美蘭, 等.帕尼培南—倍他米隆在惡性血液病化療后合并感染中的經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用[J].中華內(nèi)科雜志, 2011, 50(2): 157.

[15] 吳迪炯, 周郁鴻, 葉寶東, 等.血液病與骨髓微血管研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2011, 31(11): 871.

[16] 王小勇.骨髓活檢在血液病診斷中的臨床應(yīng)用研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2012, 16(21): 131.