閆英劍，蘇 靜，趙俊銘，李 茜，馬雪敏，王俊霞(.石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校口腔系，河北 石家莊 050000；.河北省實驗動物實驗室，河北醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)研究室，河北 石家莊 05007)

·論著·

咬牙合干擾大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨的炎性因子基因表達

閆英劍1，蘇 靜1，趙俊銘1，李 茜1，馬雪敏1，王俊霞2
(1.石家莊醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？谇幌?，河北 石家莊 050000；2.河北省實驗動物實驗室，河北醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)研究室，河北 石家莊 050017)

目的采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測咬牙合干擾對實驗大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨的炎性因子表達。方法選用6周齡雌性SD大鼠9只，隨機分為咬牙合紊亂組、去除咬牙合紊亂組和正常對照組,每組3只。制造咬牙合干擾動物模型。6周后，咬牙合紊亂組不做處理，去除咬牙合紊亂組去除咬牙合干擾，正常對照組不做處理。8周后切取大鼠右側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)，采用RT-PCR方法檢測顳下頜關(guān)節(jié)軟骨中白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)，白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及γ干擾素(interferon -γ，IFN-γ)的表達。結(jié)果在咬牙合干擾條件下，RT-PCR檢測顯示炎性因子IL-1、IL-6及TNF-α在各組大鼠中均有表達，但咬牙合紊亂組和去除咬牙合紊亂組的炎性因子表達均高于對照組，咬牙合紊亂組IL-6和TNF-α的表達高于去除咬牙合紊亂組；3組大鼠均未檢測到IFN-γ的表達。結(jié)論咬牙合干擾條件下，炎性因子IL-1、IL-6及TNF-α在顳下頜關(guān)節(jié)軟骨中的表達增強，提示炎性因子與實驗大鼠髁突軟骨病理性改建活動有相關(guān)性。

錯牙合；顳下頜關(guān)節(jié)障礙；基因表達

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.08.011

正畸治療過程中，牙齒移動引起的牙合關(guān)系的改變，不可避免會產(chǎn)生一些暫時性的咬牙合干擾。故正畸治療可能引發(fā)的顳下頜關(guān)節(jié)病(temporomandibulardisorders，TMD)成為正畸醫(yī)師臨床工作中面對的一個棘手問題。本研究通過正畸牙齒移動方法建立大鼠的咬牙合干擾模型，觀察實驗性咬牙合干擾條件下大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor，TNF-α)及γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)基因的表達，探討咬牙合干擾對顳下頜關(guān)節(jié)軟骨炎性因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物來源與分組：選用6周齡雌性SD大鼠9只(購于河北省實驗動物中心，合格證號 910276)，隨機分為咬牙合紊亂組、去除咬牙合紊亂組和正常對照組,每組3只。

1.2 實驗材料和試劑：①正畸科臨床用分牙皮圈(3M公司生產(chǎn))，聚甲基丙烯酸甲酯(室溫固化型)；②Marker，焦碳酸二乙酯；③RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生物公司產(chǎn)品)；④瓊脂糖(Sigma公司產(chǎn)品)。

1.3 模型制備：咬牙合紊亂組和去除咬牙合紊亂組大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥鈉2mL，麻醉后，將一正畸皮圈插入大鼠右側(cè)上頜及左側(cè)下頜的第一磨牙與第二磨牙之間推第一磨牙向近中移動，每天檢查1次皮圈是否脫落。1周后咬牙合紊亂組和去除咬牙合紊亂組大鼠右上頜及左下頜第一磨牙前移0.7mm,可見大鼠磨牙區(qū)咬牙合面尖窩不吻合，咬牙合關(guān)系不穩(wěn)定。大鼠咬牙合干擾模型形成。取出正畸皮圈。向間隙內(nèi)填入丙烯酸自凝樹脂，在咬牙合干擾動物模型制備6周后，去除咬牙合紊亂組大鼠腹部注射3%的戊巴比妥鈉2mL麻醉，拔出雙側(cè)造成尖窩接觸不吻合的第一磨牙，以去除咬牙合干擾因素。正常對照組不做任何處理，相同環(huán)境下飼養(yǎng)至實驗結(jié)束。3組大鼠均于實驗8周后麻醉處死；取右側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨，液氮凍存，用于RT-PCR檢測。

1.4RNA提取和定量：大鼠顳下頜關(guān)節(jié)組織在液氮中充分研磨，RNA提取按試劑盒說明書操作。1%瓊脂糖凝膠鑒定RNA完整性。

1.5 引物:根據(jù)4種細胞因子CNA序列，參考文獻分別設(shè)計上游和下游引物，由上海生工生物工程公司合成,見表1。

表1 細胞因子的RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences for cytokines

1.6 RT-PCR： cDNA第一鏈，取RT產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系2×PCRMix 10μL； RT產(chǎn)物 1μL；上游引物 1μL；下游引物 1μL；補水至 20μL)。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s(IL-1 61℃；IL-6 66℃； IFN-γ70℃； TNF-α 61℃； GAPDH 72℃)；退火30s；72℃延伸30s；35個循環(huán)(GAPDH 28個循環(huán))；72℃延伸7min。

2 結(jié) 果

RT-PCR檢測炎性因子的表達結(jié)果：用TRNzol提取大鼠顳下頜關(guān)節(jié)組織RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其濃度及完整性(圖1)。 RT-PCR檢測炎癥相關(guān)細胞因子的表達顯示，IL-1(圖2)、IL-6(圖3)及TNF-α(圖4)在各組大鼠中均有表達，且咬牙合紊亂組和去除咬牙合紊亂組的表達均高于正常對照組，咬牙合紊亂組IL-6和TNF-α的表達高于去除咬牙合紊亂組。在各組大鼠中均未檢測到IFN-γ(圖 5)的表達。

圖1 SD大鼠RNA(A)和GAPDH mRNA(B)的表達

1～3.咬牙合紊亂組；4～6.正常對照組；7～9未除咬牙合紊亂組

Figure 1 The RNA (A) and the GAPDH mRNA (B) expression of SD rat

Lane 1-3.Experiment A;Lane 4-6.Control;Lane 7-9.Experiment B

圖2 SD大鼠細胞因子IL-1 mRNA的表達

1～3.咬牙合紊亂組；4～6.正常對照組；7～9未除咬牙合紊亂組

Figure 2 Cytokine IL-1 mRNA expression of SD rats

Lane 1-3.Experiment A；Lane 4-6.Control;Lane 7-9.Experiment B

圖3 SD大鼠細胞因子IL-6 mRNA的表達

1～3.咬牙合紊亂組；4～6.正常對照組；7～9未除咬牙合紊亂組

Figure 3 Cytokine IL-6 mRNA expression of SD rats

Lane 1-3.Experiment A;Lane 4-6.Control;Lane 7-9.Experiment B

圖 4 SD大鼠細胞因子TNF-α mRNA的表達

1～3.咬牙合紊亂組；4～6.正常對照組；7～9未除咬牙合紊亂組

Figure 4 Cytokine TNF-α mRNA expression in rats

Lane 1-3.Experiment A;Lane 4-6.Control;Lane 7-9.Experiment B

圖5 SD大鼠細胞因子IFN-γ mRNA的表達

1～3.咬牙合紊亂組；4～6.正常對照組；7～9未除咬牙合紊亂組

Figure 5 Cytokine IFN-γ mRNA expression of SD rats

Lane 1-3.Experiment A;Lane 4-6.Control;Lane 7-9.Experiment B

3 討 論

有學(xué)者[1-2]先后報道了通過建立漸進性咬牙合紊亂動物模型觀察獼猴、新西蘭大白兔和大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨的改建情況。其造模方法科學(xué)性、可操作性較強，通過在大鼠第一和第二磨牙間放置橡皮圈，以第二和第三磨牙作為支抗，利用橡皮圈溫和持續(xù)地彈性推動第一磨牙逐步向近中移動。本研究采用相同的造模方法，以RT-PCR方法檢測顳下頜關(guān)節(jié)軟骨中IL-1、IL-6、TNF-α及 IFN-γ的表達，旨在進一步探討細胞炎性因子與實驗大鼠髁突軟骨病理性改建活動的相關(guān)性。

研究[3]表明IL-1作為骨關(guān)節(jié)病的一種重要致病因子可誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)的丟失，抑制軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達。IL-1在骨關(guān)節(jié)病發(fā)病中的作用引起了學(xué)者的廣泛重視。焦巖濤等[4]利用體外培養(yǎng)兔髁狀突軟骨細胞，觀察了IL-1對生長、增殖動力學(xué)的影響，得出IL-1抑制髁狀突軟骨細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生，IL-1在骨關(guān)節(jié)病發(fā)病中發(fā)揮著重要作用的結(jié)論。Kubota等[5]在TMD患者的關(guān)節(jié)液中液檢測到IL-1參與關(guān)節(jié)組織的破壞。Ijima等[6]在鼠TMD中證明了IL-1通過誘導(dǎo)TMD軟骨細胞和關(guān)節(jié)盤細胞合成基質(zhì)金屬蛋白酶導(dǎo)致軟骨基質(zhì)蛋白質(zhì)的破壞。在本研究中，咬牙合紊亂組和去除咬牙合紊亂組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨中炎性因子IL-1的表達較正常對照組增強，進一步驗證IL-1直接參與破壞關(guān)節(jié)軟骨導(dǎo)致TMD的病理過程。

IL-6在機體的免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、造血調(diào)控等過程中均發(fā)揮重要的作用。它的作用與組織中的含量有關(guān)，正常水平對機體有利，產(chǎn)生過多會引起一系列炎性損害。梁曉龍等[7]采用雙抗體加心酶聯(lián)免疫法發(fā)現(xiàn)TMD患者關(guān)節(jié)液中IL-6的水平明顯高于正常對照組。胡開進等[8]用自制撞擊裝置造成山羊雙側(cè)顳頜關(guān)節(jié)間接性創(chuàng)傷,分別于傷后2、7、10和30d取材,并以正常TMD作為對照,用免疫組織化學(xué)法進行觀察；發(fā)現(xiàn) TMD創(chuàng)傷后髁突軟骨中IL-6的表達明顯強于正常對照組,其著色程度越靠近結(jié)構(gòu)破壞區(qū)越明顯；得出結(jié)論，IL-6在TMD創(chuàng)傷后導(dǎo)致TMD骨關(guān)節(jié)病過程中起重要作用。本研究顯示咬牙合紊亂組和去除咬牙合紊亂組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中IL-6的水平明顯高于正常對照組。與上述研究結(jié)果一致。提示IL-6參與了破壞顳下頜關(guān)節(jié)組織的病理過程。

劉文華等[9]研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)力作用于TMD后，TNF-α作為破骨細胞活化因子可直接導(dǎo)致軟骨細胞凋亡并伴有關(guān)節(jié)軟骨退變。Spears等[10]和Wajant等[11]將抗胸腺細胞血清和弗氏完全佐劑注入成年雄性兔雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)，采用基因微點陣分析、蛋白質(zhì)斑跡和酶聯(lián)免疫吸附測定等方法檢測TNF-α，結(jié)果顯示TNF-α濃度較對照組增加。劉蕾等[12]通過建立大鼠漸進性咬牙合紊亂導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)退行性變的動物模型，采用蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學(xué)染色的方法觀察咬牙合改變情況下TNF-α在髁突軟骨中表達的變化及規(guī)律。提示TNF-α參與了漸進性咬牙合紊亂所致的髁突軟骨病理性改建活動。本研究采用RT-PCR方法通過對咬牙合干擾條件下大鼠顳下頜關(guān)節(jié)中炎性因子TNF-α的檢測發(fā)現(xiàn)，咬牙合紊亂組和去除咬牙合紊亂組的表達高于正常對照組。與上述實驗研究結(jié)果一致。

本研究同時觀察了咬牙合干擾消除后炎性因子的表達情況，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6在去除咬牙合紊亂組的表達水平較咬牙合紊亂組有所降低。提示炎性因子參與關(guān)節(jié)髁突軟骨分解代謝的作用在咬牙合干擾消除后有所減弱。

Takahashi等[13]研究報道在TMD患者關(guān)節(jié)液中曾檢出IFN-γ(其檢出率29% )，而梁曉龍等[7]研究結(jié)果卻沒有檢測到IFN-γ的表達，本研究與梁小龍等研究結(jié)果一致。IFN-γ又稱免疫干擾素，主要由T細胞產(chǎn)生，是巨噬細胞活化因子，能夠促進巨噬細胞吞噬能力和炎癥反應(yīng)，主要活性是參與免疫調(diào)節(jié)，是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子。本研究未檢測到IFN-γ表達可能與樣本含量少或觀察時間短等因素有關(guān)，目前有關(guān)IFN-γ在大鼠關(guān)節(jié)軟骨中是否存在尚未定論，仍有待于進一步研究證實。

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(本文編輯：許卓文)

OCCLUSALINTERFERENCEONEXPRESSIONOFINFLAMMATORYFACTORGENEINTEMPOROMANDIBULARJOINTCARTILAGEOFRATS

YANYingjian1,SUJing1,ZHAOJunming1,LIQian1,MAXuemin1,WANGJunxia2
(1.DepartmentofStomatology,ShijiazhuangMedicalCollege，Shijiazhuang050000，China;2.KeyLaboratoryofExperimentalAnimalinHebeiProvince，LaboratoryofMolecularBiology,HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveReversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)wasusedforinflammatoryfactorexpressioninexperimentalrattemporomandibularjointcartilagebytheocclusalinterference.MethodsThesixweekoldfemaleSD9ratswererandomlydividedintoocclusaldisordergroup,removedocclusaldisordergroupandnormalcontrolgroup,3ratsineachgroup.Theocclusalinterferenceanimalmodelwasestablished.Aftersixweeks,occlusaldisordergroupdidnotreceiveanytreatment,removedocclusaldisordergroupwasridofocclusalinterference,normalcontrolgroupservedasnormalcontrol.Aftereightweeks,theratsweresacrificed,therightsideofthetemporomandibularjointwascutout.RT-PCRwasusedtodetectinterleukin-1(IL-1),interleukin-6(IL-6)，tumornecrosisfactorα(TNF-α),andinterferon-γ(IFN-γ)expressioninthetemporomandibularjointcartilage.ResultsInocclusalinterferencecondition,RT-PCRresultsshowedinflammatorycytokinesIL-1,IL-6andTNF-αinratsofdifferentgroupswereexpressed.However,theinflammatorycytokinesexpressionoftheexperimentalgroupwerehigherthanthoseofcontrolgroup.IL-6andTNF-αexpressioninocclusaldisordergroupwerehigherthanthoseofremovedocclusaldisordergroup.IFN-γexpressioninthreegroupswasnotdetected.ConclusionUndertheocclusalinterferencecondition,theexpressionoftheinflammatorycytokinesIL-1,IL-6andTNF-αinthetemporomandibularjointcartilagegotenhancement.Theseresultssuggestedthatinflammatorycytokinesandtemporomandibularjointcondylarremodelinginratsactivitycorrelated.

malocclusion；temporomandibularjointdisorders；geneexpression

2013-11-28；

2014-01-15

閆英劍(1974-),女,河北唐山人，石家莊醫(yī)學(xué)高

等?？茖W(xué)校主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事口腔臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)研究。

R783.5

A

1007-3205(2014)08-0897-04