陳 超，張奉超(江蘇省徐州市兒童醫(yī)院麻醉科，江蘇 徐州 221000)

·論著·

美金胺對(duì)大鼠腦缺血再灌注誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶障礙的影響

陳 超，張奉超
(江蘇省徐州市兒童醫(yī)院麻醉科，江蘇 徐州 221000)

目的探討美金胺對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注(global cerebral ischemia/reperfusion，I/R)誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶障礙的影響。方法通過4動(dòng)脈結(jié)扎建立大鼠全腦缺血模型，在缺血后連續(xù)5d腹腔注射美金胺，采用Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)測(cè)定，通過焦油紫染色觀察海馬神經(jīng)元的存活情況。結(jié)果與生理鹽水對(duì)照組比較，假手術(shù)組和美金胺組逃逸潛伏期明顯縮短(P<0.01)；I/R組逃逸潛伏期明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組和美金胺組(P<0.01)，與生理鹽水對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與生理鹽水對(duì)照組比較，假手術(shù)組和美金胺組穿越平臺(tái)時(shí)間、在原西北象限游泳的百分比和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)，而I/R組穿越平臺(tái)時(shí)間、在原象限游泳的百分比和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞較假手術(shù)組和美金胺組明顯減少(P<0.01)，但仍與生理鹽水對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論美金胺可以改善大鼠全腦缺血再灌注所致的學(xué)習(xí)記憶障礙，該作用可能通過減輕缺血性神經(jīng)元損傷實(shí)現(xiàn)。

缺血再灌注損傷；大鼠；神經(jīng)元；記憶障礙

急性缺血性卒中后很多患者遺留學(xué)習(xí)記憶障礙[1]。腦缺血低氧所致血管性癡呆嚴(yán)重危害著人類的生命健康，已經(jīng)成為現(xiàn)代老年人的重要疾病。美金胺作為改善學(xué)習(xí)記憶的藥物用于治療老年癡呆已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但美金胺對(duì)缺血性腦損傷造成的學(xué)習(xí)記憶障礙的作用尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在大鼠全腦缺血/再灌注模型中，觀察了注射美金胺后大鼠學(xué)習(xí)記憶的改變以及海馬神經(jīng)元數(shù)目的變化，并分析了其可能的作用機(jī)制。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑：健康雄性SD大鼠，每只250～300g，共64只，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。行為學(xué)檢測(cè)每組10只，形態(tài)學(xué)分析每組6只。美金胺購于美國Sigma公司，生理鹽水購于徐州市中心醫(yī)院。

1.2SD大鼠腦缺血模型的建立：除了假手術(shù)組之外，其他組大鼠按Pulsinelli為大鼠建立4動(dòng)脈結(jié)扎模型[2]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(ishemia-reperfusion,I/R)組、生理鹽水對(duì)照(saline)組和美金胺(memantine)組，每組16只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用20%濃度的水合氯醛(300～350mg/kg)腹腔注射使其麻醉，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并實(shí)施椎動(dòng)脈電凝術(shù)。術(shù)后12h，在動(dòng)物處于清醒狀態(tài)下，結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成全腦缺血15min，然后復(fù)灌5d。以缺血?jiǎng)游矬w征及表現(xiàn)作為判斷依據(jù)，評(píng)價(jià)SD大鼠腦缺血模型的可靠性。假手術(shù)組16只處理同實(shí)驗(yàn)組，但雙側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎。

1.3 給藥：美金胺溶解于生理鹽水中，I/R組缺血后以10mg/kg的劑量立刻腹腔注射美金胺，1次/d，共5d。Saline組腹腔注射相同體積的生理鹽水。Sham組不給藥，只給生理鹽水。

1.4 大鼠行為學(xué)檢測(cè)：于晚上注射完美金胺或者生理鹽水第2天進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。Morris水迷宮的主體部分是一個(gè)內(nèi)含站臺(tái)的圓形主水池，水池高55cm，直徑1m。圓形主水池分為西北(northwest,NW)、東北(northeast,NE)、東南(southeast,SE)、西南(southwest,SW)4個(gè)象限，在NW象限正中放置一個(gè)直徑為10cm、高38cm的圓形透明平臺(tái)，平臺(tái)距離水池壁20cm，在主水池中注入清水，使水面高于透明平臺(tái)2cm，往水池中加入墨水，直至透明平臺(tái)不可見為止。將圓形主池置于光照良好的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，保持水溫在(23.0±0.5)℃,保持訓(xùn)練期間水迷宮外的參考物不變。實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)前1d下午將大鼠放入水中自由游泳2min，以熟悉實(shí)驗(yàn)環(huán)境。歷時(shí)4d，每天在不同象限各訓(xùn)練1次(Trial)，每次訓(xùn)練的入水點(diǎn)隨機(jī)選擇，但是所有大鼠需要在同一個(gè)入水點(diǎn)入水，且放入大鼠時(shí)需將老鼠面向水池壁，記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，該時(shí)間即為逃逸潛伏期。如大鼠超過120s仍找不到平臺(tái)，即引導(dǎo)其爬上平臺(tái)，并將該次實(shí)驗(yàn)的逃逸潛伏期記為120s。每次實(shí)驗(yàn)中無論是自主爬上平臺(tái)的還是被引導(dǎo)登上平臺(tái)的大鼠，均讓其在平臺(tái)上休息60s。將每只大鼠4次/d逃逸潛伏期的算術(shù)平均值作為該大鼠這一天的學(xué)習(xí)成績(jī)記錄下來?？臻g探索實(shí)驗(yàn)為訓(xùn)練完畢第2天拆臺(tái)，記錄原平臺(tái)象限即NW象限探索實(shí)踐占總時(shí)間(120s)的百分比和120s內(nèi)大鼠穿過原平臺(tái)的次數(shù)。

1.5 組織學(xué)方法：于復(fù)灌第5天，先注射水合氯醛將大鼠麻醉，然后開左胸暴露心臟，針頭插入主動(dòng)脈需自心尖穿過左心室，用生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行刑事灌注。將灌注后的大鼠斷頭取腦，對(duì)取出的腦組織用4%的多聚甲醛固定12h左右。使用梯度乙醇對(duì)腦塊進(jìn)行脫水，并于二甲苯中透明，浸蠟后包埋。包臘后腦塊切片，厚5μm，經(jīng)脫蠟，脫二甲苯，于0.1%焦油紫染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片后，光鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 美金胺對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響：行為學(xué)測(cè)定前1d下午，將各組大鼠放入水中自由游泳2min，使其熟悉實(shí)驗(yàn)環(huán)境并觀察其游泳姿勢(shì)。所有大鼠在圓形主水池中積極探索，游泳姿勢(shì)無異常。與Saline組比較，假手術(shù)組和美金胺組逃逸潛伏期明顯縮短(P<0.01)；I/R組逃逸潛伏期明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組和美金胺組(P<0.01)，與Saline組差異已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Saline組比較，假手術(shù)組和美金胺組在穿越平臺(tái)時(shí)間、原NW象限游泳的百分比和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)，而I/R組穿越平臺(tái)時(shí)間、在原象限游泳的百分比和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞較假手術(shù)組和美金胺組明顯減少(P<0.01)，與Saline組差異已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

GroupsEscapelatency(s)Timeofcrossingplatform(s)PercentageofswimminginNW(%)NumberofneuronalcellinhippocamalCA1region(n)Saline110．28±10．245．42±1．7518．62±4．7645．42±6．76Sham70．35±9．21?15．36±1．98?56．37±5．28?238．69±10．35?Memantine88．64±8．15?9．45±1．69?42．56±3．70?#178．25±8．98?#I/R117．38±7．75#△5．96±1．26#△19．32±3．36#△56．91±8．26#△ F58．83373．164327．3231177．259 P0．0000．0000．0000．000

*P<0.01vssaline group #P<0.01vssham group △P<0.01vsmemantine group byqtest

2.2 形態(tài)學(xué)觀察：假手術(shù)組椎體細(xì)胞3～4層，排列整齊緊密，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰，尼氏體染色濃密規(guī)則(圖1A)；I/R組椎體細(xì)胞排列雜亂、部分缺失，大多數(shù)椎體細(xì)胞變性，胞核固縮，呈三角形，結(jié)構(gòu)不清，尼氏體減少，染色變淡，胞漿嗜酸性變(圖1B);美金胺組椎體細(xì)胞2～3層，排列較整齊緊密，細(xì)胞核較大而圓，核仁清晰，尼氏體染色較濃密規(guī)則，僅有少量細(xì)胞出現(xiàn)胞核固縮，呈三角形，尼氏體減少，染色變淡，胞漿嗜酸性變( 圖1C)；Saline組椎體細(xì)胞改變與I/R組相似，細(xì)胞排列雜亂、部分缺失，大多數(shù)椎體細(xì)胞變性，胞核固縮，呈三角形，結(jié)構(gòu)不清，尼氏體減少，染色變淡，胞漿嗜酸性變(圖1D)。

圖1 美金胺對(duì)缺血/再灌注神經(jīng)元的保護(hù)作用(×400)

A.假手術(shù)組;B.I/R組;C.美金胺組;D.生理鹽水對(duì)照組

Figure 2 Neuroprotective effect of on cerebral ischemia/ reperfusion(×400)

A.Sham group;B.I/R group;C.Memantine group;D.Saline group

3 討 論

海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，其神經(jīng)元作為感覺整合中樞可以接收和處理大量信息，并通過與其他腦區(qū)以往已有的儲(chǔ)存信息核對(duì)后形成記憶。急性缺血性卒中后很多患者遺留學(xué)習(xí)記憶障礙[1]。有實(shí)驗(yàn)研究[2-3]表明，腦缺血再灌注可導(dǎo)致成年大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力受損，其機(jī)制可能與損傷所致的海馬神經(jīng)元丟失有關(guān)。Morris水迷宮是用來測(cè)定大鼠的定位航行和空間搜索能力的測(cè)量精度較好的方法，可用來研究大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[4-5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血/再灌注后，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力受到損害，同時(shí)焦油紫染色顯示海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的丟失程度與學(xué)習(xí)記憶的下降一致。表明海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的丟失在腦缺血/再灌注模型大鼠認(rèn)知功能下降中發(fā)揮重要作用。

腦缺血/再灌注過程中，谷氨酸興奮毒性發(fā)揮著重要的作用，缺血/再灌注引起的神經(jīng)元凋亡及死亡主要是由谷氨酸受體中的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)的過度激活介導(dǎo)的[6]。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，生理?xiàng)l件下，作為正常的神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元之間信息傳遞中發(fā)揮重要作用，所以，NMDA受體發(fā)揮著生理和病理的作用，既有利于神經(jīng)元正常功能的發(fā)揮，而過度激活時(shí)又會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的病理改變。腦缺血會(huì)導(dǎo)致海馬神經(jīng)元受損，出現(xiàn)不同程度神經(jīng)元損傷：缺血狀態(tài)下海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞層出現(xiàn)排列紊亂，細(xì)胞體積縮小、胞漿皺縮；嗜酸性增強(qiáng)、胞核固縮，核染色呈藍(lán)紫色致密球狀，嚴(yán)重固縮呈嗜酸性深紫色神經(jīng)元。研究發(fā)現(xiàn)，在獲得新信息方面海馬結(jié)構(gòu)完整性對(duì)于學(xué)習(xí)記憶至關(guān)重要，CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡會(huì)引起嚴(yán)重學(xué)習(xí)記憶障礙。

美金胺是一種中等親和力、開放性、非競(jìng)爭(zhēng)性的通道阻滯劑。一定濃度的美金胺，可以優(yōu)先抑制NMDA受體的過度活化，卻不影響正常的受體活性[7]。當(dāng)受體離子通道過度開放時(shí)，美金胺雖然優(yōu)先進(jìn)入通道，但是由于解離速率快，不會(huì)持續(xù)積聚在通道上而對(duì)突觸的正常傳遞產(chǎn)生干擾，所以相對(duì)安全[8]。同時(shí)，體外培養(yǎng)幼鼠大腦皮層神經(jīng)元中，美金胺拮抗NMDA所引起的神經(jīng)元損傷作用[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示美金胺明顯減少了再灌注5d后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的死亡，改善了腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能障礙。但美金胺改善腦缺血誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能是否與保護(hù)了缺血性神經(jīng)元有關(guān)，以及保護(hù)神經(jīng)元損傷的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：許卓文)

EFFECTOFMEMANTINEONLEARNINGANDMEMORYDISORDERINDUCEDBYCEREBRALISCHEMIA/REPERFUSIONINJURYOFRATS

CHENChao,ZHANGFengchao
(DepartmentofAnesthesiology,XuzhouChildren′sHospital,JiangsuProvince,Xuzhou221000,China)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofmemantineonlearningandmemorydisorderinducedbycerebralischemia/reperfusion(I/R)ofrats.MethodsModelofcerebralischemiawasestablishedbythefour-vesselocclusionmethod.Memantinewasintraperitoneallyinjectedforfivedaysaftertheischemia.CresylvioletstainingwasusedtoobservethesurvivalneuronsinpyramidalcelllayerofthehippocamalCA1regionandMorriswatermazetestwasperformed.ResultsComparedwiththoseofsalinecontrolgroup,theescapelatencyoftheorientationnavigationexperimentinshamgroupandmemantinegroupwassignificantlyshortened(P<0.01);theescapelatencyofI/Rgroupwassignificantlylongerthanthatofshamgroupandmemantinegroup(P<0.01),buttheescapelatencyofI/Rgrouphadnosignificantdifferencecomparedwiththatsalinecontrolgroup(P>0.05);Comparedwiththoseofcontrolgroup,thecrossingplatformtime,timepercentofswimminginnorthwestandneuronalcelllossinhippocamalCA1regioninshamgroupandmemantinegroupsignificantlyraised(P<0.01),butthethreeitemsofI/Rgroupsignificantlyreducedincomparisonwiththeabovetwogroups(P<0.01),whiletheystillhadnosignificantdifferencescomparedwiththoseofsalinegroup(P>0.05).ConclusionMemantinecanimprovethelearningandmemorydisorderinducedbycerebralischemia/reperfusioninratsthroughdecreasingneuronalcelldeath.

reperfusioninjury;rats;neurons;memorydisordes

2014-01-08；

2014-03-12

陳超(1962-)，男，江蘇徐州人，江蘇省徐州市兒童醫(yī)院主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事臨床麻醉學(xué)研究。

R619.9

A

1007-3205(2014)10-1296-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.11.016