韓素麗

慢性乙型肝炎患者M(jìn)DSC的含量測定及其免疫抑制作用

韓素麗

目的 探討并分析正常人對照組及慢性乙型肝炎患者外周血中MDSCs含量與病毒載體、疾病預(yù)后的關(guān)系。方法 分別用流式細(xì)胞儀檢測健康人和慢性乙型肝炎患者外周血MDSCs含量,并進(jìn)行病毒載量和疾病預(yù)后資料的相關(guān)分析。結(jié)果 慢性乙型肝炎組的MDSCs百分含量相與正常對照組相比, 顯著增多(P<0.05)；而且通過病例資料分析發(fā)現(xiàn)MDSCs含量不僅隨著慢性HBV病重程度逐級升高,而且與慢性乙肝疾病預(yù)后HBV-DNA含量密切相關(guān)。結(jié)論 MDSCs可作為慢性乙型肝炎的一種新型血清標(biāo)志物, 用于患者的診斷和預(yù)后指標(biāo)。

HBV；MDSCs；流式細(xì)胞術(shù)

乙型病毒(Hepatitis B virus, HBV)是一種嗜肝DNA病毒,常引起患者急性肝炎和慢性肝炎的發(fā)生, 除可發(fā)生肝細(xì)胞壞死、纖維化和硬化外, 嚴(yán)重者還可引起肝細(xì)胞癌的發(fā)生。而且大部分乙型肝炎患者主要為慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B)。而我國又位于肝病大國之首, 因此, 如何預(yù)防和治療乙肝病毒感染和慢性乙肝患者疾病的惡化顯得尤為重要。

近年有研究表明, 慢性乙型肝炎患者難以治愈主要與患者外周血、肝臟組織中存在的骨髓系來源抑制細(xì)胞(myeloidderived suppressor cells, MDSCs)有關(guān), 該細(xì)胞群不但種類繁多,而且具有強大的、廣泛的免疫抑制作用, 并且還能誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生, 因此, 研究攻克MDSCs產(chǎn)生的免疫抑制作用意義重大, 它是解決慢性乙肝治療的一大難題。而關(guān)于MDSCs與慢性乙型肝炎中的研究尚不多見,因此, 本課題擬對慢性乙型肝炎的患者外周血中MDSC細(xì)胞數(shù)量與HBV病毒載量進(jìn)行研究, 并探討MDSCs與疾病轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的關(guān)系, 為慢性乙型肝炎的治療或監(jiān)測用藥提供另外新的思路和線索。

1 材料與方法

1. 1 材料

研究對象：實驗組為本院確診的慢性乙型肝炎患者中,根據(jù)生化指標(biāo)分別篩選輕度慢性乙型肝炎組、中度慢性乙型肝炎組和重度慢性乙型肝炎組三組各150例；其中, 平均年齡(38±7)歲；對照組為健康者為200例, 平均年齡(45±5)歲。

試劑：CD34、CD33、CD15流式抗體, ALT、AST和TBI ELISA試劑盒、細(xì)胞裂解液等。

儀器：流式細(xì)胞儀、全自動生化分析儀、PCR擴(kuò)增儀、超速離心機(jī)等。

1. 2 方法

1. 2. 1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組外周血中MDSCs細(xì)胞含量 ①將3~5 ml慢性乙型肝炎患者和健康者的靜脈血分別置于含有肝素鈉的真空采血管中, 室溫放置一段時間, 于 4 h 內(nèi)處理所采集的標(biāo)本。②將紅細(xì)胞裂解液恢復(fù)至室溫后, 加入個采集管中。③ 根據(jù)樣品編號對流式管進(jìn)行編號, 然后按順序擺放于試管架上, 每管加入 100 μl 全血。④向各管中加入一定量的相應(yīng)流式抗體, 震蕩混勻后, 于4℃避光孵育 30 min。⑤每管加入紅細(xì)胞裂解液 3~4 ml, 置冰上裂解 10 min 后, 1200 rpm 離心 10 min, 棄上清。⑥如果紅細(xì)胞未完全裂解, 則加入1~2 ml 紅細(xì)胞裂解液于冰上繼續(xù)裂解 5 min, 直至紅細(xì)胞完全裂解。然后在1200 rpm 離心 10 min, 棄上清。⑦加入流式洗液3~5 ml, 混勻, 并于1500 rpm離心10 min。⑧重復(fù)上一步操作。⑨最后每管加入 200~300 μl 流式細(xì)胞洗液將細(xì)胞沉淀充分懸浮, 然后通過流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1. 2. 2 全自動生化分析儀測定ALT、AST和TBI 各組分別抽取肝素抗凝血3~4 ml, 3500 rpm 離心 5 min, 上機(jī)測定血漿中的ALT、AST和TBI。

1. 2. 3 PCR方法檢測各組乙肝病毒載量 各組分別抽取非抗凝血3~4 ml, 分離血清, 擴(kuò)增儀分析病毒載量。

表1 各組外周血MDCSs含量百分比

1. 2. 4 ELISA法檢測血清NOS水平 按試劑盒的使用說明進(jìn)行操作。

1. 2. 5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)將采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理, 數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示。統(tǒng)計方法均采用單因素方差分析, 相關(guān)分析采用Pearosn分析, 而且以P<0.05認(rèn)定為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 健康對照組、慢性乙型肝炎輕度組、慢性乙型肝炎中度組、慢性乙型肝炎重度組外周血中MDSCs細(xì)胞含量 通過流式細(xì)胞儀對各組進(jìn)行MDSCs百分含量的檢測, 各組含量如下表1, MDSCs在乙肝患者外周血中相對對照組均顯示高表達(dá)(P<0.05),而且MDSCs的含量隨著慢性乙肝攜帶者病情的增加的增大。

2. 2 各實驗組患者中血漿的MDSCs含量及HBV-DNA含量間的相關(guān)分析 通過分析MDSCs含量和患者HBV-DNA含量的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)MDSCs與HBV-DNA含量呈正相關(guān)(r=0.86, P<0.05), 即隨著HBV含量的增大, 外周血中出現(xiàn)的MDSCs的含量百分比增大。

3 討論

近年研究證實, 免疫耐受、高HBV-DNA血癥以及乙型肝炎病毒的變異是導(dǎo)致慢性乙型肝炎的抗病毒治療失敗的主要原因, 其中, 免疫耐受是重中之重［1］。而且根據(jù)最近研究報道, 骨髓產(chǎn)生的髓系來源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppoessor cells,MDSCs)是機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受的主要來源, 它能通過產(chǎn)生不同的免疫抑制細(xì)胞如Treg細(xì)胞、TAM腫瘤巨噬細(xì)胞、NSC自然抑制性細(xì)胞等, 抑制宿主免疫激活、進(jìn)而促進(jìn)感染性疾病的進(jìn)程, 導(dǎo)致各種免疫炎癥疾病和腫瘤的發(fā)生［2］。因此本課題通過對MDSCs在慢性乙型肝炎中的作用進(jìn)行研究, 即通過對正常對照組、不同程度慢性乙肝患者的外周血進(jìn)行MDSCs細(xì)胞含量的流式檢測分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 外周血中慢性乙型肝炎患者的MDSCs細(xì)胞含量與正常對照組的相比, 顯著升高, 說明外周血中MDSCs細(xì)胞含量的增加可能是導(dǎo)致HBV-DNA大量復(fù)制、慢性乙肝疾病惡化的因素之一［3］。不僅如此, 通過進(jìn)行MDSCs含量與HBV-DNA含量相關(guān)分析, 還發(fā)現(xiàn), 兩者呈正相關(guān), 說明兩者可能具有相互促進(jìn)作用, 提示MDSCs的產(chǎn)生是促進(jìn)HBV-DNA復(fù)制的結(jié)果［4］, 提示, MDSCs可作為HBV患者的一種診治指標(biāo), 應(yīng)用于臨床。

外周血MDSCs與HBV-DNA復(fù)制和疾病病程密切相關(guān),可作為慢性乙型肝炎的一種診斷指標(biāo)或檢測, 有望應(yīng)用于臨床。

［1］ 李婕.慢性乙型肝炎患者HBV抗原特異性Th17細(xì)胞亞群的功能及其免疫調(diào)控機(jī)制的臨床研究.浙江大學(xué), 2011.

［2］ 江匯涓,邵宗鴻.MDSCs的功能研究進(jìn)展與應(yīng)用前景.臨床血液學(xué)雜志, 2013,26(5):348-351.

［3］ 馬萍.替比夫定治療對HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者免疫功能的影響.天津醫(yī)科大學(xué), 2012.

［4］ Osruand-RosenbergS,Sinha P.Myeloid-derived supperssor cells:linking inflammation and cacer. Cancer Immunol, 2009, 182(8): 4499-4506.

Content determination of MDSC for chrionic hepatitis B patients and its effect on the immune suppression

HAN Su-li. Shanxi Medical University
(Peace Hospital Affiliated to Changzhi Medical college), Taiyuan 030001, China

Objective To investigate the relationship between the analysis and the normal control group and chronic hepatitis B in the peripheral blood of patients with viral vectors, MDSCs content and the prognosis of the disease. Methods Patients with healthy people were detected by flow cytometry and chronic hepatitis B, peripheral blood MDSCs content, correlation analysis and viral load and disease outcome data. Results the percentage of MDSCs phase and the chronic hepatitis B group compared with the normal control group, increased significantly (P<0.05); and through the case analysis found that MDSCs was not only with chronic HBV severity gradually increased, and closely related to chronic hepatitis B disease prognosis HBV-DNA content. Conclusion MDSCs can be used as a new type of chronic hepatitis B serum marker for diagnosis and prognosis, patients.

HBV; MDSCs; Flow cytometry

030001 山西醫(yī)科大學(xué)/山西省長治市長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院檢驗科

趙素蓮