張蕾 邢紹芝 張婷婷 趙磊磊

甲胎蛋白抑制PTEN活性導(dǎo)致肝癌細(xì)胞耐受ATRA誘導(dǎo)的凋亡的研究

張蕾 邢紹芝 張婷婷 趙磊磊

目的 研究分析甲胎蛋白對(duì)PTEN活性產(chǎn)生抑制引起肝癌細(xì)胞耐受ATRA發(fā)生凋亡。方法 選取2012年11月~2013年11月期間本院診治36例肝癌患者, 將患者術(shù)后肝癌細(xì)胞制成標(biāo)本。結(jié)果 人體肝癌HepG2與Bel 7402細(xì)胞均存在PTEN表達(dá), 經(jīng)160 μmol/L的ATRA處理24 h后可加強(qiáng)這些細(xì)胞的PTEN的表達(dá)。Co-IP技術(shù)實(shí)驗(yàn)得知甲胎蛋白可與PTEN相結(jié)合, 最終對(duì)ATRA產(chǎn)生影響。結(jié)論 肝癌細(xì)胞中表達(dá)的甲胎蛋白可與PTEN相結(jié)合, 最終發(fā)現(xiàn)AFP為肝癌細(xì)胞耐受ATRA的重要因子。

甲胎蛋白；PTEN活性；肝癌細(xì)胞；ATRA

肝癌是人類健康最大的威脅疾病中的一種, 因?yàn)槭艿讲《拘愿窝住h(huán)境等有關(guān)因素的影響, 導(dǎo)致肝癌發(fā)病的機(jī)率逐漸升高。因?yàn)楦伟┘?xì)胞會(huì)出現(xiàn)再生、轉(zhuǎn)移, 同時(shí)癌細(xì)胞對(duì)藥物存在一定的耐受, 從而增加了治療難度。因此, 充分掌握肝癌耐藥因子的機(jī)制, 對(duì)臨床肝癌的治療十分重要。甲胎蛋白(簡(jiǎn)稱AFP)是肝癌細(xì)胞合成的具有很高特異性的蛋白質(zhì)之一, 絕大多數(shù)肝癌患者在發(fā)病期會(huì)產(chǎn)生AFP基因高表達(dá)的特點(diǎn), 并且AFP是肝癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。有資料指出, 肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的AFP能加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的雙重作用。PTEN則是將3-磷酸肌醇(簡(jiǎn)稱PIP3)水解成2-磷酸肌醇(簡(jiǎn)稱PIP2)的磷酸酶, 同時(shí)可以避免3-磷酸肌醇激酶(簡(jiǎn)稱PI3K)磷酸化蛋白激酶B(簡(jiǎn)稱PKB/AKT), 導(dǎo)致PI3K/ AKT信號(hào)傳導(dǎo)被中斷, 可見是一種非常關(guān)鍵的抑癌基因。AFP的生物學(xué)性質(zhì)可能還存在對(duì)ATRA抗凋亡產(chǎn)生誘導(dǎo)作用,但是肝癌細(xì)胞合成的AFP在機(jī)體中肝癌細(xì)胞耐受凋亡過程具體發(fā)揮的作用報(bào)道較少, 現(xiàn)本次研究進(jìn)一步探討AFP在人體肝癌細(xì)胞中對(duì)PTEN活性產(chǎn)生的影響, 總結(jié)如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2012年11月~2013年11月期間本院診治36例肝癌患者, 并在患者術(shù)后肝癌組織中提取HLE、HepG2、Bel 7402細(xì)胞加以培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)材料：ser 473多克隆抗體、兔抗人AKT/PKB多克隆抗體、小鼠抗人AFP單克隆抗體均源自PS公司。Β-Actin單克隆抗體及魯米諾試劑源自SC公司。兔抗人PTEN多克隆抗體由美國(guó)實(shí)驗(yàn)室視覺公司生產(chǎn)。二抗是羊抗兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶連接的羊抗鼠。FITC標(biāo)記的羊抗兔與TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗由美國(guó)杰克遜IR公司生產(chǎn)。RNA干擾試劑盒, 即癌/ GFP / Neo si-RNA表達(dá)載體試劑盒由上海吉瑪公司提供。Ly294002及ATRA由Sigma提供。pcDNA3.1載體源自廣州泰盛公司。

1. 2 方法 應(yīng)用Western blotting法對(duì)全反式維甲酸(簡(jiǎn)稱ATRA)進(jìn)行分析并處理人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞24 h后, PTEN表達(dá)產(chǎn)生變化的情況［2］。通過免疫共沉淀(簡(jiǎn)稱Co-IP)技術(shù)分析PTEN與AFP之間相互作用。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)PTEN與AFP在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。通過RNA干擾(即指RNAi)技術(shù)對(duì)AFP的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用, 然后采用ATRA處理24 h后, 檢測(cè)細(xì)胞中PTEN表達(dá)發(fā)生變化的情況, 同時(shí)研究蛋白激酶B(簡(jiǎn)稱AKT)的磷酸化程度。再利用pcDNA3.1質(zhì)粒、人體afp基因連接組成表達(dá)AFP的載體(簡(jiǎn)稱pcDNA3.1-afp), 最后轉(zhuǎn)染成不表達(dá)AFP的人體肝癌HLE細(xì)胞。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0對(duì)組間試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)加以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 應(yīng)用t法對(duì)組間計(jì)量資料進(jìn)行檢驗(yàn), 應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)組間計(jì)數(shù)資料進(jìn)行檢驗(yàn)。如若對(duì)比差異P＜0.05, 則充分表明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞均存在PTEN的表達(dá),通過160 μmol/L濃度的ATRT處理24 h后可加強(qiáng)這些肝癌細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)。經(jīng)Co-IP技術(shù)實(shí)驗(yàn)可知AFP可與PTEN相結(jié)合。采用共聚焦纖維鏡監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)PTEN與AFP之間共定位在細(xì)胞漿。在干擾AFP表達(dá)以后, 發(fā)現(xiàn)PTEN表達(dá)顯著升高,表達(dá)前后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而抑制AFP表達(dá)以后,ATRA可明顯增強(qiáng)Bel 7402細(xì)胞中PTEN的表達(dá), 同時(shí)可以使AKT磷酸化受到抑制。當(dāng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-afp載體以后, 肝癌HLE細(xì)胞中存在AFP表達(dá), 同時(shí)能和PTEN相結(jié)合, 由此可知pcDNA3.1-afp載體可以促進(jìn)AKT磷酸化(即為p-AKT), 從而對(duì)抗ATRA使HLE細(xì)胞增殖受到抑制。詳見表1、圖1~3。

圖1 HepG2、Bel 7402細(xì)胞在PTEN的表達(dá)

圖2 Bel 7402細(xì)胞的具體表達(dá)

3 討論

肝癌細(xì)胞中出現(xiàn)AFP高表達(dá)的現(xiàn)象, 可能與癌細(xì)胞在體內(nèi)過度的生殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲存在很大關(guān)系。有資料指出使AFP表達(dá)被抑制, 可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞逐漸凋亡。AFP同細(xì)胞中的部分信息物質(zhì)相互結(jié)合, 進(jìn)而對(duì)凋亡信息的傳導(dǎo)產(chǎn)生影響。其中, AKT、PTEN以及AFP表達(dá)的檢測(cè), 能分析出AFP與AKT磷酸化、PTEN功能之間的關(guān)系［3,4］。本次研究得出人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞、HLE內(nèi)均存在PTEN表達(dá)。但HepG2、Bel 7402細(xì)胞高表達(dá)AFP, HLE細(xì)胞則不表達(dá)AFP。AKT為肝癌細(xì)胞傳遞、生長(zhǎng)信號(hào)的重要因子, 在癌細(xì)胞生長(zhǎng)期間起到中心信息物質(zhì)的作用, 所以AKT活化程度說明癌細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。本次研究得出, 人體內(nèi)肝癌Bel 7402細(xì)胞由于受到ATRA作用, 以至于PTEN表達(dá)明顯提高, 由此得知PTEN基因可以在肝癌細(xì)胞內(nèi)有效被激活。通過免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的AFP能夠與PTEN相互結(jié)合, 組合成復(fù)合體。進(jìn)一步表明PTEN與AFP之間具有相互作用的可能。利用共聚焦纖維鏡監(jiān)測(cè)Bel 7402細(xì)胞內(nèi)的PTEN、AFP可見, 其多分布在細(xì)胞漿內(nèi), 僅有一小部分PTEN蛋白分布在細(xì)胞核中, 由此表明PTEN蛋白與AFP在細(xì)胞漿內(nèi)能夠出現(xiàn)共定位現(xiàn)象。

AFP可通過下面兩種途徑對(duì)PTEN磷酸化作用造成抑制［5,6］：①AFP可抑制PTEN表達(dá), 以利于降低PTEN水解生成PIP3。②AFP能夠與PTEN相互結(jié)合, 利用兩者之間的互相作用, 對(duì)PTEN磷酸酶活性產(chǎn)生抑制, 使AFP能夠最快速度的使PI3K/AKT信號(hào)被激活。可見AFP對(duì)PI3K/AKT信號(hào)激活的過程, 考慮是AFP強(qiáng)化癌細(xì)胞生殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲的主要機(jī)制［7］。AFP的生物學(xué)性質(zhì)能夠?qū)π畔⒎肿訕赢a(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。因?yàn)镻TEN正常表達(dá)情況下, 可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性, 可見靶向干擾AFP表達(dá)能有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡, 并且抑制AFP強(qiáng)化癌細(xì)胞生長(zhǎng)的新的有效策略。

表1 干擾AFP表達(dá)后基因變化情況

圖3 HepG2 細(xì)胞的具體表達(dá)

［1］ 朱明月,符史干,李孟森,等.甲胎蛋白抑制 PTEN 活性導(dǎo)致肝癌細(xì)胞耐受 ATRA 誘導(dǎo)的凋亡.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2011, 38(3):227-238.

［2］ 米登海.PTEN與VEGF在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及相互作用.華中科技大學(xué), 2010,12(20):132-133.

［3］ 王麗.抑癌基因PTEN在肝癌組織中的表達(dá)及HCV核心蛋白對(duì)PTEN作用的研究.第四軍醫(yī)大學(xué), 2010,12(10):455-456.

［4］ 姚悅萍,王娟華,陸忠華,等.血清甲胎蛋白異質(zhì)體對(duì)肝細(xì)胞癌的診斷意義.實(shí)用肝臟病雜志, 2011,23(4):541-542.

［5］ 陳偉.抑癌基因PTEN、p27在肝細(xì)胞性肝癌組織中的表達(dá)及臨床相關(guān)性研究.安徽醫(yī)科大學(xué), 2010,23(13):557-559.

［6］ 沈慧.原發(fā)性肝癌中PTEN蛋白表達(dá)及其與HBV感染的關(guān)系.山西醫(yī)科大學(xué), 2010,22(11):821-825.

［7］ 秦敏. PTEN、p-Akt在白藜蘆醇抑制人肝癌細(xì)胞增殖與促進(jìn)其凋亡中的作用.河北醫(yī)科大學(xué), 2010,14(10):451-453.

Inhibited the activity of PTEN by alpha fetal protein caused resistance to all trans retinoic acid of hepatoma cells

ZHANG Lei, XING Shao-zhi, ZHANG Ting-ting,
et al. Department of Epidemiology, Binzhou Medical University, Binzhou 256600, China

Objective To study and analyze inhibition of PTEN activity by alpha fetal protein caus ed resistance to all trans retinoic acid of hepatoma cells. Methods Select in November 2012 to November 2013 in the hospital make a diagnosis and give treatment of 36 cases of liver cancer patients, the patients of postoperative liver cancer cell specimen. Results Human hepatocellular carcinoma HepG2 and Bel 7402 cell expression PTEN, 24, 160 mu of mol/L ATRA treatment can strengthen the cells the expression of PTEN as a child. Co-IP technology experiment told that AFP can be combined with PTEN, ultimately affect ATRA. Conclusion The liver cancer cells express AFP can be combined with PTEN, eventually found the AFP for the most important factors of liver cancer cells resistant to ATRA.

Alpha fetal protein; PTEN activity; Liver cancer cells; ATRA

256600 濱州醫(yī)學(xué)院傳染病學(xué)教研室(張蕾)；濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科(邢紹芝), 檢驗(yàn)科(張婷婷 趙磊磊)