楊揚等

[摘要] 目的 構建PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。 方法 將白介素2敲除（IL-2 KO）小鼠與P-選擇素糖蛋白配體-1敲除（PSGL-1 KO）小鼠雜交，剪尾提DNA后用PCR法檢測小鼠的基因型。 結果 IL-2 KO小鼠與PSGL-1 KO小鼠雜交三代后，PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型構建成功。 結論 將IL-2 KO小鼠與PSGL-1 KO小鼠雜交三代后，成功建立了PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。

[關鍵詞] P-選擇素糖蛋白配體-1；白介素-2；P-選擇素糖蛋白配體-1敲除小鼠；白介素-2敲除小鼠；動物模型

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）23-0007-03

[Abstract] Objective To construct the PSGL-1+/-；IL-2-/- mice model. Methods PSGL-1 KO mice were mated with IL-2 KO mice. Mice were genotyped by PCR after cut the tail and extracted DNA. Results After PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice for three generations， PSGL-1+/-；IL-2-/- mice were obtained. Conclusion PSGL-1+/-；IL-2-/- mice are established through PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice.

[Key words] PSGL-1；IL-2；PSGL-1 knockout mice；IL-2 knockout mice；Animal model

基因工程小鼠（genetically engineered mouse，GEM）是隨著細胞工程、分子生物學的發(fā)展，利用基因打靶、轉基因、嵌合體等技術對實驗小鼠基因組有目的的改造或修飾，使小鼠有特定的特性或生物表型，以研究基因的功能、調控機制及與其他基因的相互作用等[1]?；蚬こ绦∈筮€可以作為人類的疾病模型，如自發(fā)腫瘤模型、自發(fā)動脈粥樣硬化模型等，研究疾病的發(fā)病機制和藥物研究。基因工程小鼠包括基因敲除小鼠、基因替換小鼠和轉基因小鼠[2，3]。本實驗所用的兩種基因工程小鼠為基因敲除小鼠，分別是白細胞介素-2敲除小鼠（IL-2 KO mouse）和P-選擇素糖蛋白配體-1敲除小鼠（PSGL-1 KO mouse）。為了進一步研究白細胞介素-2和P-選擇素糖蛋白配體-1在炎癥、心血管及腫瘤疾病中的共同作用，將IL-2 KO 小鼠和PSGL-1 KO 小鼠雜交建立了PSGL-1基因敲除及IL-2為雜合子的PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型?？梢栽倮么诵∈竽Ｐ徒⒏鞣N炎癥、心血管及腫瘤等疾病模型，所以此模型可作為研究PSGL-1和IL-2在炎癥、心血管和腫瘤中作用及相互關系的良好動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 實驗動物及飼養(yǎng) P-選擇素糖蛋白配體-1敲除小鼠（PSGL-1 KO小鼠）和白介素-2敲除小鼠（IL-2 KO小鼠）購自美國Jackson實驗室，共4只，雌雄各2只，周齡6～8周。小鼠在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，動物房溫度控制在22℃～28℃，濕度為50%～70%，并且保持12 h明/12 h暗。小鼠的飼料購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心并經60Co輻照滅菌的全營養(yǎng)飼料。飲用水高壓滅菌。實驗設計時間為2013年6月～2014年3月。

1.1.2 試劑 PCR引物由廣州英駿公司合成，蛋白酶K及dNTP購自Sigma公司，Taq酶、Tris飽和酚及氯仿從廣州康龍公司訂購。

1.2 方法

1.2.1 IL-2基因的鑒定 突變型IL-2引物的序列：TCG AAT TCG CCA ATG ACA AGA CGC T；野生型IL-2引物的序列：CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT；通用引物序列：GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C。PCR反應條件：94℃變性3 min，94℃ 30 s，64℃ 45 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)，72℃2 min充分延伸。在500 bp處有一條帶為IL-2純合子的小鼠，在342 bp處有一條帶為野生型小鼠，在500 bp和324 bp處各有一條帶為雜合子小鼠。

1.2.2 PSGL-1基因的鑒定 野生型PSGL-1基因引物序列：P1：5'-TCAAAA TC GTCATCCCCAAC -3，P2：5'-AGCTTCCTT GTGCTGCTGAC -3''；突變型PSGL-1基因引物序列：P1：5'-CCTT CTAT CGCC TTCT TGA CG-3'，P2：5'-TCAAAA TCGTCA TCCCCAAC-3'。PCR反應的條件：94℃變性5 min，94℃30 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)35次；72℃延伸2 min。PSGL-1基因敲除的純合子小鼠在500 bp處有一條帶，PSGL-1基因為雜合子的小鼠在140 bp和500 bp處各有一條帶。

1.2.3 PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型的構建 用IL-2 KO 雄性小鼠與PSGL-1 KO雌性小鼠雜交，第一代小鼠PSGL-1和IL-2基因均為雜合子，用PSGL-1+/-；IL-2+/-雄性小鼠與IL-2 KO雌性小鼠或者用PSGL-1+/-；IL-2+/-雌性小鼠與IL-2 KO雄性小鼠再進行雜交，在第二代可得到PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠。endprint

2 結果

2.1 IL-2 KO小鼠與PSGL-1 KO小鼠雜交情況

IL-2 KO 雄性小鼠與PSGL-1 KO雌性小鼠以1∶2的比例雜交兩籠，所生小鼠IL-2和PSGL-1基因全部為雜合子，共獲得24只。用第一代小鼠與IL-2 KO 小鼠雜交，第二代共獲得小鼠136只，其中PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠38只。

2.2 PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠的鑒定結果

把PSGL-1 KO小鼠和IL-2 KO小鼠雜交，在第三代小鼠中，1、3號和4號小鼠為PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠，2號小鼠為PSGL-1+/-；IL-2+/-小鼠。圖1A中的5號小鼠為PSGL-1基因的陽性對照，圖1B中的5號小鼠為IL-2基因的陽性對照。

3討論

白介素-2（IL-2）是由Morgan等在1976年發(fā)現(xiàn)的由T淋巴細胞分泌的一種因子，主要由活化的Ⅰ型輔助淋巴細胞分泌，主要功能是刺激T細胞的增生，促進T細胞的增殖；還促進NK細胞和B細胞的活化、增殖；促進細胞毒性T淋巴細胞的產生和增殖等[4-6]。白介素-2還可以促使NK細胞、T淋巴細胞產生腫瘤壞死因子和干擾素等，而且目前已廣泛應用于抗炎和抗腫瘤治療[7-10]。

P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1， PSGL-1）是一種粘附分子，在幾乎所有類型的白細胞表面表達，是選擇素的配體[11-14]。因此，PSGL-1與表達于白細胞的L-選擇素及表達于活化的血管內皮細胞的E-選擇素和P-選擇素相互作用，從而介導白細胞的黏附[15，16]。由于白細胞黏附與炎癥、凝血、傷口修復及腫瘤轉移等密切相關，因此PSGL-1介導的白細胞黏附作用可在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用。

IL-2敲除小鼠是由Ivan Horak等在1991年構建成功的，IL-2純合子敲除小鼠在4～9周時會出現(xiàn)脾、淋巴結腫大、腸道炎癥及貧血等疾病的癥狀。由于白介素-2與PSGL-1在炎癥、腫瘤等疾病中都發(fā)揮重要作用，為了探索兩者是否具有協(xié)同或拮抗作用，本實驗將白細胞介素-2敲除小鼠和黏附分子P-選擇素糖蛋白配體基因敲除小鼠雜交建立了PSGL-1基因敲除及IL-2為雜合子的PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型，在飼養(yǎng)的過程中，由于PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠的免疫力會降低，易感染，因此在飼養(yǎng)的過程中對無菌的要求會更加嚴格，小鼠必須飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，飲用水及飼料必須是無菌的?？梢岳么诵∈竽Ｐ徒⒏鞣N炎癥、心血管、自身免疫性疾病及腫瘤模型，也為研究PSGL-1和IL-2在炎癥、心血管和腫瘤疾病中的作用及相互關系提供了良好的動物模型。

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