賀江　楊戀　楊品紅

摘要：依據(jù)稀土離子La3+能夠增強(qiáng)四環(huán)素紫外吸收強(qiáng)度的原理，建立一種四環(huán)素殘留快速檢測(cè)方法。水產(chǎn)品中的四環(huán)素殘留用EDTA-McIlvaine緩沖液提取，提取液用HLB固相萃取小柱凈化；甲醇洗脫液氮吹濃縮至干后的殘?jiān)? mL 混合溶液（VLa3+溶液 ∶VTris-HCl緩沖溶液 ∶V水=1 ∶1 ∶8）溶解，搖勻，于室溫下靜止反應(yīng)30 min，最后將樣液置于微量比色皿中在390 nm處測(cè)定吸光度，并換算出抗生素殘留濃度。結(jié)果表明，所建立的方法具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，可在水產(chǎn)養(yǎng)殖地或超市等現(xiàn)場(chǎng)推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：稀土元素；紫外吸收；四環(huán)素；抗生素殘留；快速測(cè)定；水產(chǎn)品

中圖分類號(hào)： TS201.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0299-02

收稿日期：2013-10-25

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科研項(xiàng)目（編號(hào)：12C0828）；湖南文理學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目（2011）；湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院省級(jí)平臺(tái)開放項(xiàng)目（編號(hào)：SKYPT201202）。

作者簡(jiǎn)介：賀江（1983—），男，江西萍鄉(xiāng)人，博士，講師，主要從事食品安全與食品生物技術(shù)研究。E-mail：hejiang1119@163.com。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)近年來在我國(guó)發(fā)展迅速，但抗生素殘留問題是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素之一[1]。建立有效的殘留檢測(cè)技術(shù)體系是對(duì)抗生素殘留問題進(jìn)行有效控制的前提與基礎(chǔ)?，F(xiàn)有的抗生素殘留檢測(cè)方法主要有2類：一類是基于HPLC等精密儀器的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[2-3]，但這類方法所用的儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，也不便于現(xiàn)場(chǎng)操作；另一類是基于微生物抑制[4-5]或酶聯(lián)免疫反應(yīng)[6]的簡(jiǎn)便方法，但是微生物抑制法耗時(shí)較長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)法的關(guān)鍵試劑（抗體）制備較困難。因此，建立簡(jiǎn)便有效的抗生素殘留檢測(cè)方法成為一項(xiàng)被廣泛關(guān)注且具有較大現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值的研究工作[7]。因此，本研究選取水產(chǎn)養(yǎng)殖中較常用的四環(huán)素為對(duì)象，依據(jù)稀土元素能夠增強(qiáng)四環(huán)素紫外吸收強(qiáng)度的原理[8]，結(jié)合對(duì)魚肉組織樣品前處理方案的探討，建立一種簡(jiǎn)便有效、可在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行操作的四環(huán)素殘留檢測(cè)方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮的鯽魚（經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法測(cè)定無四環(huán)素殘留），購(gòu)自湖南省常德市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自德國(guó)Dr公司；99% La2O3，購(gòu)自江西省贛州市科明銳有色金屬材料有限公司；色譜甲醇，購(gòu)自默克公司；其他試劑均為分析純；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2儀器與設(shè)備

UV-1750紫外-可見分光光度儀（日本島津公司），TDL-40B 低速離心機(jī)，MTN-2800D氮吹儀，勻漿機(jī)，HLB固相萃取小柱，微型比色皿，其他常規(guī)玻璃器皿。

1.3方法

1.3.1主要試劑的配制

1.3.1.1四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)母液精確稱取2 mg四環(huán)素，加水完全溶解，定容至100 mL，配制成20 μg/mL四環(huán)素母液，置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2EDTA-McIlvaine緩沖溶液稱取一定量的Na2EDTA、Na2HPO4 和檸檬酸，分別配制成0.1、0.2、0.4 mol/L的溶液。按照3 ∶2的體積比混合Na2HPO4和檸檬酸，配制成McIlvaine緩沖液。將0.1 mol/L EDTA溶液與McIlvaine緩沖液按照1 ∶1的體積比混合，配制成EDTA-McIlvaine緩沖溶液（混合后pH值約為4）。

1.3.1.3La3+溶液稱取0.163 g La2O3，溶于少量濃HCl中，小心蒸發(fā)近干，加水定容至100 mL，配制成 10 mmol/L 儲(chǔ)備液，保存于冰箱，使用時(shí)稀釋至1 mmol/L。

1.3.1.4Tris-HCl緩沖溶液將50 mL 0.1 mol/L Tris溶液和38.5 mL 0.1 mol/L HCl溶液混合，定容至 100 mL，此時(shí)pH值約為7.6。

1.3.2稀土離子La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性的影響取2份 1 mL四環(huán)素母液分別加入到25 mL容量瓶中，其中一份依次加入2.5 mL 1 mmol/L La3+溶液和2.5 mL Tris-HCl緩沖溶液，再加水定容；另一份則加入2.5 mL Tris-HCl緩沖溶液，再加水定容；室溫靜置30 min后，在200～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.3.3四環(huán)素濃度與紫外吸收強(qiáng)度的線性相關(guān)性取不同量的四環(huán)素母液于25 mL容量瓶中，再依次加入2.5 mL 1 mmol/L La3+溶液和2.5 mL Tris-HCl緩沖溶液，最后加水定容，使體系中四環(huán)素濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、20、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL。室溫靜置30 min后測(cè)定紫外吸光度，并分析四環(huán)素濃度與紫外吸光度的相關(guān)性。

1.3.4魚肉組織中四環(huán)素殘留檢測(cè)過程

1.3.4.1稱樣提取將新鮮的鯽魚洗凈，去鱗去皮，除去內(nèi)臟，剔除魚骨，將魚肉置于勻漿機(jī)內(nèi)打碎、拌勻，除去絞不碎的物質(zhì)。稱取5.00 g魚肉組織于15 mL塑料離心管中，加入 4 mL EDTA-McIlvaine緩沖液均質(zhì)提取，3 000 r/min離心 5 min，取上清液；魚肉組織繼續(xù)用緩沖液提取2次，每次提取 3 mL，并將3次提取液合并。

1.3.4.2凈化濃縮將提取液以1滴/s的速度通過預(yù)先經(jīng)5 mL甲醇和5 mL水活化的HLB固相萃取小柱，待上清液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL 甲醇與水的混合液（體積比為5 ∶95）淋洗；棄去全部流出液，用10 mL甲醇洗脫，并收集洗脫液于潔凈干燥的離心管中；最后將洗脫液在40 ℃下用氮吹儀濃縮至干。

1.3.4.3溶解測(cè)定于上述離心管中加入1 mL 混合液（VLa3+溶液 ∶VTris-HCl緩沖溶液 ∶V水=1 ∶1 ∶8）溶解，搖勻，于室溫下靜置反應(yīng)30 min，測(cè)定其吸光度。endprint

1.3.5檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度評(píng)價(jià)

1.3.5.1靈敏度評(píng)價(jià)將5份空白魚肉組織（5 g/份）按照“134”所述方法進(jìn)行處理和吸光度測(cè)定，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，以吸光度為3倍標(biāo)準(zhǔn)差時(shí)所對(duì)應(yīng)的四環(huán)素殘留濃度為方法的檢出限。

1.3.5.2準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液制備成濃度分別為0.4、0.8、1.2 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”節(jié)進(jìn)行處理和測(cè)定，并計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3.5.3精確度評(píng)價(jià)取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液制備成濃度為0.8 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”進(jìn)行處理和計(jì)算，并計(jì)算變異系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1稀土離子La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性的影響

通過對(duì)照試驗(yàn)分析了La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，四環(huán)素與稀土離子La3+作用后，其紫外吸收特性發(fā)生明顯改變。一方面最大吸收峰的位置由350 nm移至390～392 nm，并且峰型呈“平臺(tái)”狀；另一方面最大吸收峰處的吸光度明顯增大。其原因在于，四環(huán)素分子具有一定的共軛體系，其本身在350 nm附近的紫外區(qū)有1個(gè)弱的吸收帶，當(dāng)它與稀土離子反應(yīng)形成絡(luò)合物后，在配位場(chǎng)的作用下，在吸光度增加的同時(shí)，其電子遷躍的激發(fā)能減弱，吸收帶紅移到390 nm處。La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性的改變有利于四環(huán)素殘留定量檢測(cè)方法的建立，“平臺(tái)”狀峰型有利于提高檢測(cè)的穩(wěn)定性；而吸光度的增加則有利于提高檢測(cè)靈敏度。

2.2四環(huán)素濃度與紫外吸收強(qiáng)度的線性相關(guān)性

在確定了La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性影響的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)進(jìn)一步分析了四環(huán)素濃度在0.2～10.0 μg/mL范圍內(nèi)變化時(shí)，待測(cè)物濃度與吸光度之間的相關(guān)性，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著檢測(cè)體系中四環(huán)素濃度的增大，其最大吸收峰處的吸光度逐漸增大，對(duì)數(shù)據(jù)作進(jìn)一步回歸分析后發(fā)現(xiàn)，二者呈良好的線性關(guān)系。說明四環(huán)素濃度與紫外吸光度的關(guān)系符合“朗伯比爾定律”，該體系可用于四環(huán)素殘留的定量檢測(cè)；經(jīng)計(jì)算，最大吸收峰處（390 nm）的摩爾吸光系數(shù)（ε）為14 400 L/（mol·cm）。

2.3魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度的測(cè)定效果

實(shí)際樣品中的殘留檢測(cè)效果除了與最終的測(cè)定方法相關(guān)外，還與樣品的前處理方法密切相關(guān)。本研究制備了不同四環(huán)素殘留濃度的模擬樣品，按“1.3.4”所述的樣品處理方案處理后進(jìn)行吸光度測(cè)定，將四環(huán)素殘留濃度與相應(yīng)吸光度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度與樣品吸光度也呈良好的相關(guān)性，說明可以利用該方法進(jìn)行四環(huán)素殘留檢測(cè)。

2.4檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度評(píng)價(jià)

按照上述方法，對(duì)5份空白魚肉組織進(jìn)行測(cè)定，其吸光度為0.007 8±0.003 4，以3倍標(biāo)準(zhǔn)差（即0.010 2）帶入“2.3”中的回歸方程，求得該檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限為0.095 μg/g。對(duì)3份添加濃度分別為0.4、0.8、1.2μg/g模擬樣品進(jìn)行測(cè)

定，測(cè)得回收率在80%～110%之間，說明該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性良好。對(duì)添加濃度為0.8 μg/g的3份模擬樣品進(jìn)行測(cè)定，其添加回收率穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為3.09%，說明該方法精密度較高。

3結(jié)論與討論

利用紫外-可見分光光度法進(jìn)行定量分析具有操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但是其檢測(cè)靈敏度通常難以滿足藥物殘留檢測(cè)的要求。本研究從檢測(cè)方法本身和配套前處理方案2個(gè)方面考慮，以提高檢測(cè)效果。在檢測(cè)方法上，通過在檢測(cè)體系中引入稀土離子La3+，使四環(huán)素的紫外吸光度增大，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度。在樣品前處理方案方面，通過對(duì)提取液進(jìn)行凈化以消除基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)穩(wěn)定性；利用空白基質(zhì)液配置標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)而制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性；對(duì)提取液進(jìn)行濃縮（配合使用微量比色皿）進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。本研究所建立方法的最低檢出限為0.095 μg/g，雖然與HPLC、GC等方法的靈敏度仍有較大差距，但低于我國(guó)相關(guān)法規(guī)規(guī)定的水產(chǎn)品中四環(huán)素最大殘留限量（0.1 μg/g）[9]，說明該方法能夠滿足作為現(xiàn)場(chǎng)初篩（陰性/陽性判別）手段的要求。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱崗，高會(huì)平. 介紹一種新型水產(chǎn)環(huán)保型抗菌素——中魚尼考[J]. 中國(guó)水產(chǎn)，2002（10）：85.

[2]袁冬梅，李一婧. 養(yǎng)殖水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素殘留的高效液相色譜測(cè)定法[J]. 食品工業(yè)科技，2008（1）：281，285.

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[9]動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[J]. 中國(guó)豬業(yè)，2010（8）：10-12.endprint

1.3.5檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度評(píng)價(jià)

1.3.5.1靈敏度評(píng)價(jià)將5份空白魚肉組織（5 g/份）按照“134”所述方法進(jìn)行處理和吸光度測(cè)定，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，以吸光度為3倍標(biāo)準(zhǔn)差時(shí)所對(duì)應(yīng)的四環(huán)素殘留濃度為方法的檢出限。

1.3.5.2準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液制備成濃度分別為0.4、0.8、1.2 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”節(jié)進(jìn)行處理和測(cè)定，并計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3.5.3精確度評(píng)價(jià)取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液制備成濃度為0.8 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”進(jìn)行處理和計(jì)算，并計(jì)算變異系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1稀土離子La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性的影響

通過對(duì)照試驗(yàn)分析了La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，四環(huán)素與稀土離子La3+作用后，其紫外吸收特性發(fā)生明顯改變。一方面最大吸收峰的位置由350 nm移至390～392 nm，并且峰型呈“平臺(tái)”狀；另一方面最大吸收峰處的吸光度明顯增大。其原因在于，四環(huán)素分子具有一定的共軛體系，其本身在350 nm附近的紫外區(qū)有1個(gè)弱的吸收帶，當(dāng)它與稀土離子反應(yīng)形成絡(luò)合物后，在配位場(chǎng)的作用下，在吸光度增加的同時(shí)，其電子遷躍的激發(fā)能減弱，吸收帶紅移到390 nm處。La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性的改變有利于四環(huán)素殘留定量檢測(cè)方法的建立，“平臺(tái)”狀峰型有利于提高檢測(cè)的穩(wěn)定性；而吸光度的增加則有利于提高檢測(cè)靈敏度。

2.2四環(huán)素濃度與紫外吸收強(qiáng)度的線性相關(guān)性

在確定了La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性影響的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)進(jìn)一步分析了四環(huán)素濃度在0.2～10.0 μg/mL范圍內(nèi)變化時(shí)，待測(cè)物濃度與吸光度之間的相關(guān)性，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著檢測(cè)體系中四環(huán)素濃度的增大，其最大吸收峰處的吸光度逐漸增大，對(duì)數(shù)據(jù)作進(jìn)一步回歸分析后發(fā)現(xiàn)，二者呈良好的線性關(guān)系。說明四環(huán)素濃度與紫外吸光度的關(guān)系符合“朗伯比爾定律”，該體系可用于四環(huán)素殘留的定量檢測(cè)；經(jīng)計(jì)算，最大吸收峰處（390 nm）的摩爾吸光系數(shù)（ε）為14 400 L/（mol·cm）。

2.3魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度的測(cè)定效果

實(shí)際樣品中的殘留檢測(cè)效果除了與最終的測(cè)定方法相關(guān)外，還與樣品的前處理方法密切相關(guān)。本研究制備了不同四環(huán)素殘留濃度的模擬樣品，按“1.3.4”所述的樣品處理方案處理后進(jìn)行吸光度測(cè)定，將四環(huán)素殘留濃度與相應(yīng)吸光度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度與樣品吸光度也呈良好的相關(guān)性，說明可以利用該方法進(jìn)行四環(huán)素殘留檢測(cè)。

2.4檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度評(píng)價(jià)

按照上述方法，對(duì)5份空白魚肉組織進(jìn)行測(cè)定，其吸光度為0.007 8±0.003 4，以3倍標(biāo)準(zhǔn)差（即0.010 2）帶入“2.3”中的回歸方程，求得該檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限為0.095 μg/g。對(duì)3份添加濃度分別為0.4、0.8、1.2μg/g模擬樣品進(jìn)行測(cè)

定，測(cè)得回收率在80%～110%之間，說明該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性良好。對(duì)添加濃度為0.8 μg/g的3份模擬樣品進(jìn)行測(cè)定，其添加回收率穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為3.09%，說明該方法精密度較高。

3結(jié)論與討論

利用紫外-可見分光光度法進(jìn)行定量分析具有操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但是其檢測(cè)靈敏度通常難以滿足藥物殘留檢測(cè)的要求。本研究從檢測(cè)方法本身和配套前處理方案2個(gè)方面考慮，以提高檢測(cè)效果。在檢測(cè)方法上，通過在檢測(cè)體系中引入稀土離子La3+，使四環(huán)素的紫外吸光度增大，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度。在樣品前處理方案方面，通過對(duì)提取液進(jìn)行凈化以消除基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)穩(wěn)定性；利用空白基質(zhì)液配置標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)而制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性；對(duì)提取液進(jìn)行濃縮（配合使用微量比色皿）進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。本研究所建立方法的最低檢出限為0.095 μg/g，雖然與HPLC、GC等方法的靈敏度仍有較大差距，但低于我國(guó)相關(guān)法規(guī)規(guī)定的水產(chǎn)品中四環(huán)素最大殘留限量（0.1 μg/g）[9]，說明該方法能夠滿足作為現(xiàn)場(chǎng)初篩（陰性/陽性判別）手段的要求。

參考文獻(xiàn)：

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1.3.5檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度評(píng)價(jià)

1.3.5.1靈敏度評(píng)價(jià)將5份空白魚肉組織（5 g/份）按照“134”所述方法進(jìn)行處理和吸光度測(cè)定，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，以吸光度為3倍標(biāo)準(zhǔn)差時(shí)所對(duì)應(yīng)的四環(huán)素殘留濃度為方法的檢出限。

1.3.5.2準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液制備成濃度分別為0.4、0.8、1.2 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”節(jié)進(jìn)行處理和測(cè)定，并計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3.5.3精確度評(píng)價(jià)取3份魚肉組織（5 g/份），通過添加四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液制備成濃度為0.8 μg/g模擬樣品，靜置2 h后，按“1.3.4”進(jìn)行處理和計(jì)算，并計(jì)算變異系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1稀土離子La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性的影響

通過對(duì)照試驗(yàn)分析了La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，四環(huán)素與稀土離子La3+作用后，其紫外吸收特性發(fā)生明顯改變。一方面最大吸收峰的位置由350 nm移至390～392 nm，并且峰型呈“平臺(tái)”狀；另一方面最大吸收峰處的吸光度明顯增大。其原因在于，四環(huán)素分子具有一定的共軛體系，其本身在350 nm附近的紫外區(qū)有1個(gè)弱的吸收帶，當(dāng)它與稀土離子反應(yīng)形成絡(luò)合物后，在配位場(chǎng)的作用下，在吸光度增加的同時(shí)，其電子遷躍的激發(fā)能減弱，吸收帶紅移到390 nm處。La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性的改變有利于四環(huán)素殘留定量檢測(cè)方法的建立，“平臺(tái)”狀峰型有利于提高檢測(cè)的穩(wěn)定性；而吸光度的增加則有利于提高檢測(cè)靈敏度。

2.2四環(huán)素濃度與紫外吸收強(qiáng)度的線性相關(guān)性

在確定了La3+對(duì)四環(huán)素紫外吸收特性影響的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)進(jìn)一步分析了四環(huán)素濃度在0.2～10.0 μg/mL范圍內(nèi)變化時(shí)，待測(cè)物濃度與吸光度之間的相關(guān)性，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著檢測(cè)體系中四環(huán)素濃度的增大，其最大吸收峰處的吸光度逐漸增大，對(duì)數(shù)據(jù)作進(jìn)一步回歸分析后發(fā)現(xiàn)，二者呈良好的線性關(guān)系。說明四環(huán)素濃度與紫外吸光度的關(guān)系符合“朗伯比爾定律”，該體系可用于四環(huán)素殘留的定量檢測(cè)；經(jīng)計(jì)算，最大吸收峰處（390 nm）的摩爾吸光系數(shù)（ε）為14 400 L/（mol·cm）。

2.3魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度的測(cè)定效果

實(shí)際樣品中的殘留檢測(cè)效果除了與最終的測(cè)定方法相關(guān)外，還與樣品的前處理方法密切相關(guān)。本研究制備了不同四環(huán)素殘留濃度的模擬樣品，按“1.3.4”所述的樣品處理方案處理后進(jìn)行吸光度測(cè)定，將四環(huán)素殘留濃度與相應(yīng)吸光度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，魚肉組織中四環(huán)素殘留濃度與樣品吸光度也呈良好的相關(guān)性，說明可以利用該方法進(jìn)行四環(huán)素殘留檢測(cè)。

2.4檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度評(píng)價(jià)

按照上述方法，對(duì)5份空白魚肉組織進(jìn)行測(cè)定，其吸光度為0.007 8±0.003 4，以3倍標(biāo)準(zhǔn)差（即0.010 2）帶入“2.3”中的回歸方程，求得該檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限為0.095 μg/g。對(duì)3份添加濃度分別為0.4、0.8、1.2μg/g模擬樣品進(jìn)行測(cè)

定，測(cè)得回收率在80%～110%之間，說明該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性良好。對(duì)添加濃度為0.8 μg/g的3份模擬樣品進(jìn)行測(cè)定，其添加回收率穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為3.09%，說明該方法精密度較高。

3結(jié)論與討論

利用紫外-可見分光光度法進(jìn)行定量分析具有操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但是其檢測(cè)靈敏度通常難以滿足藥物殘留檢測(cè)的要求。本研究從檢測(cè)方法本身和配套前處理方案2個(gè)方面考慮，以提高檢測(cè)效果。在檢測(cè)方法上，通過在檢測(cè)體系中引入稀土離子La3+，使四環(huán)素的紫外吸光度增大，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度。在樣品前處理方案方面，通過對(duì)提取液進(jìn)行凈化以消除基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)穩(wěn)定性；利用空白基質(zhì)液配置標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)而制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性；對(duì)提取液進(jìn)行濃縮（配合使用微量比色皿）進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。本研究所建立方法的最低檢出限為0.095 μg/g，雖然與HPLC、GC等方法的靈敏度仍有較大差距，但低于我國(guó)相關(guān)法規(guī)規(guī)定的水產(chǎn)品中四環(huán)素最大殘留限量（0.1 μg/g）[9]，說明該方法能夠滿足作為現(xiàn)場(chǎng)初篩（陰性/陽性判別）手段的要求。

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