孫傳伯　曹佩佩　楊有蘭等

摘要：將工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的副產(chǎn)品餅干渣加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)乳酸球菌RL-68生產(chǎn)菌種工業(yè)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，確定發(fā)酵優(yōu)化條件為：餅干渣105 g/L、番茄汁3%、最適碳氮比7，在培養(yǎng)溫度35 ℃、發(fā)酵初始pH值6.5～6.8條件下培養(yǎng)，這時(shí)乳酸球菌RL-68活菌數(shù)最高，可達(dá)7.32×109 CFU/mL。

關(guān)鍵詞：乳酸球菌；工業(yè)培養(yǎng)基；優(yōu)化；配方；發(fā)酵工藝；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0285-03

收稿日期：2013-10-14

基金項(xiàng)目：國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃（編號(hào)：201210376003、201310376006）；皖西學(xué)院研究性學(xué)習(xí)項(xiàng)目（編號(hào)：wxxyx2013062、wxxyx2013074）；安徽省高校自然科學(xué)基金（編號(hào)：KJ2011B216）。

作者簡(jiǎn)介：孫傳伯（1978—），男，安徽桐城人，碩士，講師，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)能工程。E-mail：scb19781979@126.com。乳酸菌是指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱，凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌[1-5]。乳酸菌是一群相當(dāng)龐雜的細(xì)菌，目前至少可分為18個(gè)屬，共有200多種，除極少數(shù)外，絕大部分都是人體內(nèi)必不可少且具有重要生理功能的菌群，廣泛存在于人體的腸道中。目前，已被國(guó)內(nèi)外生物學(xué)家所證實(shí)，腸內(nèi)乳酸菌與健康長(zhǎng)壽有著非常密切的直接關(guān)系。乳酸球菌是乳酸菌的一種，是工業(yè)上尤其是食品工業(yè)上的常用菌種，存在于乳制品、發(fā)酵植物食品（如泡菜、酸菜）、青貯飼料及人的腸道尤其是乳兒腸道中，具有發(fā)酵溫度高、產(chǎn)酸率相對(duì)較高、對(duì)糖利用率高、發(fā)酵時(shí)不需通氧氣等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)上具有非常廣闊的應(yīng)用前景。目前，世界上對(duì)于生產(chǎn)乳酸球菌的培養(yǎng)基有很多研究，但使用的多是實(shí)驗(yàn)室試劑，成本較大。本試驗(yàn)運(yùn)用工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的副產(chǎn)品餅干渣和玉米漿來(lái)代替生產(chǎn)乳酸球菌的碳源和氮源，探索簡(jiǎn)單、低成本、高產(chǎn)量的適用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基[6]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)菌種與材料乳酸球菌RL-68，由皖西學(xué)院生物質(zhì)煉制技術(shù)工程研究中心提供；餅干渣，由桐城雙武食品廠提供；番茄、香蕉、白菜、橘子、蘋果，均購(gòu)自安徽省六安市南門菜市場(chǎng)。

1.1.2主要儀器722分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；250B恒溫培養(yǎng)箱，江蘇金壇精達(dá)儀器制造廠生產(chǎn)；PHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；SW-CJ-1D超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.1.3培養(yǎng)基活化培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏 5、蛋白胨 5、葡萄糖 40，pH值6.0～6.5，115 ℃滅菌15 min；種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏10、蛋白胨10、葡萄糖50、乙酸鈉0.5、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.01、ZnSO4·7H2O 0.2，初始pH值為6.5～6.8，0.1 MPa 下滅菌20 min[7-10]；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨15、葡萄糖120、乙酸鈉0.5、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、NaCL 0.01、ZnSO4·7H2O 0.2，初始pH值6.5～6.8，0.1 MPa下滅菌20 min[11-13]；平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（MC培養(yǎng)基，g/L）：大豆蛋白胨5、牛肉膏粉5、酵母膏粉5、葡萄糖20、乳糖20、碳酸鈣10、瓊脂15、中性紅0.05，pH值6.0±0.2，0.1 MPa下滅菌20 min[14-16]。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)前，經(jīng)2次傳代后，挑幾環(huán)乳酸球菌RL-68菌體接種于裝有300 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，用封口膜封口，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)：500 mL錐形瓶中裝入300 mL發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，取培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種，恒溫靜置培養(yǎng)30 h[17-20]。

1.2.2測(cè)定方法活菌計(jì)數(shù)方法：平板涂布法，選擇3個(gè)合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平皿，菌落數(shù)為3個(gè)平皿的平均值；菌液吸光度測(cè)定方法：722型分光光度計(jì)在620 nm條件下比色；pH值測(cè)定方法：pH計(jì)測(cè)定。

1.2.3乳酸球菌的生長(zhǎng)曲線按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量將種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)，分別于10、12、14、16、18、20、24、26、30 h取樣測(cè)定培養(yǎng)基的吸光度（D值）。

2結(jié)果與分析

2.1乳酸球菌生長(zhǎng)曲線

在種子培養(yǎng)過(guò)程中，分別于4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、30 h取樣測(cè)定培養(yǎng)基的D值。由圖1可見(jiàn)，在前8 h，D值沒(méi)有明顯的變化，此時(shí)乳酸球菌處于延遲期，細(xì)胞正合成分裂所需要的物質(zhì)；在8～12 h D值有升高，在12～18 h D值有明顯的升高，表明菌種生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期；18 h 后D值基本保持不變，即菌種進(jìn)入穩(wěn)定期。為縮短菌種轉(zhuǎn)入發(fā)酵液中的延遲期，選擇種子培養(yǎng)中對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)液較好，故選擇18 h作為接入發(fā)酵液的時(shí)間。

2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)

2.2.1發(fā)酵培養(yǎng)基中碳氮比的影響試驗(yàn)采用工業(yè)生產(chǎn)副產(chǎn)品餅干渣作為碳源，改變發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳氮比，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其他組分不變，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后測(cè)定活菌數(shù)[21-22]。由表1可見(jiàn)，當(dāng)碳氮比小于5或者高于8時(shí)，培養(yǎng)基中活菌數(shù)數(shù)量級(jí)明顯下降，這說(shuō)明乳酸球菌RL-68對(duì)于碳氮源的利用有其自身的最適度，當(dāng)碳氮比為7時(shí)，培養(yǎng)基中的活菌數(shù)最高，可達(dá)到1.96×108 CFU/mL，故選取碳氮比為7作為優(yōu)化培養(yǎng)基的最適碳氮比。endprint

3小結(jié)與討論

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為：餅干渣105 g/L、蛋白胨15 g/L、番茄汁3%、最適碳氮比7、培養(yǎng)溫度35 ℃、靜置培養(yǎng)18 h，產(chǎn)菌量可達(dá)最高，為732×109 CFU/mL。本試驗(yàn)利用工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的副產(chǎn)品為主要原料，獲得一個(gè)簡(jiǎn)單、低成本、高產(chǎn)量、適用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基。但是，本試驗(yàn)還有待進(jìn)一步深入研究，如碳氮源固定比例問(wèn)題是否可根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況進(jìn)一步調(diào)整。另外，利用番茄汁和橘子汁發(fā)酵得到的活菌數(shù)是在同一數(shù)量級(jí)的，但由于試驗(yàn)時(shí)不是橘子的成熟季節(jié)，故選取了番茄汁，在后續(xù)試驗(yàn)中，對(duì)生長(zhǎng)因子的影響將進(jìn)一步開(kāi)展研究。

參考文獻(xiàn)：

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3小結(jié)與討論

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為：餅干渣105 g/L、蛋白胨15 g/L、番茄汁3%、最適碳氮比7、培養(yǎng)溫度35 ℃、靜置培養(yǎng)18 h，產(chǎn)菌量可達(dá)最高，為732×109 CFU/mL。本試驗(yàn)利用工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的副產(chǎn)品為主要原料，獲得一個(gè)簡(jiǎn)單、低成本、高產(chǎn)量、適用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基。但是，本試驗(yàn)還有待進(jìn)一步深入研究，如碳氮源固定比例問(wèn)題是否可根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況進(jìn)一步調(diào)整。另外，利用番茄汁和橘子汁發(fā)酵得到的活菌數(shù)是在同一數(shù)量級(jí)的，但由于試驗(yàn)時(shí)不是橘子的成熟季節(jié)，故選取了番茄汁，在后續(xù)試驗(yàn)中，對(duì)生長(zhǎng)因子的影響將進(jìn)一步開(kāi)展研究。

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3小結(jié)與討論

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為：餅干渣105 g/L、蛋白胨15 g/L、番茄汁3%、最適碳氮比7、培養(yǎng)溫度35 ℃、靜置培養(yǎng)18 h，產(chǎn)菌量可達(dá)最高，為732×109 CFU/mL。本試驗(yàn)利用工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的副產(chǎn)品為主要原料，獲得一個(gè)簡(jiǎn)單、低成本、高產(chǎn)量、適用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基。但是，本試驗(yàn)還有待進(jìn)一步深入研究，如碳氮源固定比例問(wèn)題是否可根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況進(jìn)一步調(diào)整。另外，利用番茄汁和橘子汁發(fā)酵得到的活菌數(shù)是在同一數(shù)量級(jí)的，但由于試驗(yàn)時(shí)不是橘子的成熟季節(jié)，故選取了番茄汁，在后續(xù)試驗(yàn)中，對(duì)生長(zhǎng)因子的影響將進(jìn)一步開(kāi)展研究。

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