杜娟　申磊　孫艷香

摘要：為了研究不同氨基酸不同濃度對(duì)NaCl脅迫下棉苗生理性狀和脯氨酸含量的影響，采用溫室培養(yǎng)處理，將2、4、6、8 mmol/L氨基酸與1 mol/L NaCl溶液混合后浸泡處理棉籽24 h，同設(shè)單獨(dú)鹽處理及水處理，10 d后測(cè)定棉苗生理指標(biāo)和脯氨酸含量。結(jié)果顯示，8 mmol/L瓜氨酸處理的發(fā)芽率比1 mol/L NaCl處理高很多；鳥(niǎo)氨酸處理的棉籽發(fā)芽勢(shì)基本都高于NaCl處理中棉籽的發(fā)芽勢(shì)，不同種類不同濃度氨基酸浸種對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗鮮質(zhì)量、干質(zhì)量及含水量均有不同程度的影響；所有氨基酸處理對(duì)NaCl脅迫下棉花中脯氨酸的生成均有一定的抑制作用。說(shuō)明部分種類及濃度的氨基酸能緩解鹽脅迫對(duì)棉籽萌發(fā)及棉花幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，而對(duì)脯氨酸的生成有不同程度的抑制作用。

關(guān)鍵詞：氨基酸；棉花；生理性狀；NaCl脅迫；脯氨酸

中圖分類號(hào)： S562.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0099-03

收稿日期：2014-02-19

基金項(xiàng)目：河北省教育廳項(xiàng)目（編號(hào)：Z2013014）；河北省廊坊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2013012003）。

作者簡(jiǎn)介：杜娟（1983—），女，河北冀州人，碩士，助理研究員，主要從事植物保護(hù)方面的研究。E-mail：dujuan0203@163.com。

通信作者：孫艷香，博士，教授，主要從事植物轉(zhuǎn)基因遺傳方面的研究。Tel：（0316）2188092；E-mail：yx_sun70@163.com。 NaCl脅迫會(huì)造成植物發(fā)育遲緩，抑制植物組織和器官的生長(zhǎng)和分化[1]。氨基酸能幫助植物對(duì)一些逆境作出反應(yīng)，防止葉綠體光合作用的衰減[2-3]等多種生理過(guò)程。中國(guó)鹽漬土的比例明顯高于世界平均水平，提高植物耐鹽性是克服土壤鹽漬化的一條重要途徑[4-5]。因此，研究NaCl脅迫下氨基酸與植物耐鹽性的關(guān)系具有重要意義。目前，關(guān)于氨基酸參與植物脅迫適應(yīng)的研究主要包括鹽脅迫抵抗力、調(diào)節(jié)膨壓滲透勢(shì)和陽(yáng)離子膜運(yùn)輸?shù)萚6-10]；還有文獻(xiàn)報(bào)道氨基酸能夠提高植物對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)能力，進(jìn)而提高植物的耐鹽能力[11]；近期有研究表明，NaCl處理嚴(yán)重抑制了棉苗節(jié)間伸長(zhǎng)和葉面積的擴(kuò)展，減慢了生長(zhǎng)速率，降低了干物質(zhì)積累，NaCl濃度越高，脅迫癥狀出現(xiàn)得越早[12]。本研究以棉花為材料，研究NaCl脅迫下不同種類不同濃度的氨基酸對(duì)棉花幼苗生理性狀的影響以及棉花幼苗中脯氨酸含量的變化，探討氨基酸緩解棉花在NaCl脅迫下的生理生化機(jī)理，以期為擴(kuò)大棉花在鹽漬地中的種植面積、進(jìn)一步提高棉花產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試陸地棉（Gossypium hirsutum L.）品種為農(nóng)大棉7號(hào)。

1.2研究方法

1.2.1試材培育及測(cè)定棉籽經(jīng)硫酸脫絨，清水沖洗干凈后晾干，精選外觀飽滿、大小與色澤等一致的棉籽，浸種[本試驗(yàn)中設(shè)3種氨基酸4個(gè)含量水平（分別與1 mol/L NaCl溶液混合后浸泡處理棉籽）以及水處理（水對(duì)照）、NaCl處理（鹽對(duì)照）共18個(gè)處理]至露白，選露白一致的棉籽，與草炭土 ∶珍珠巖 ∶蛭石=1 ∶1 ∶1混合于90 mm×70 mm 培養(yǎng)缽中，封上塑料膜，在光照培養(yǎng)室內(nèi)育苗，晝溫約25 ℃，夜溫約20 ℃，光強(qiáng)400 μmol/（m2·s）。每天每盆澆相同量的水，于相同條件下培養(yǎng)，其他管理措施如病蟲(chóng)害防治等相同。

自發(fā)芽開(kāi)始每天記錄發(fā)芽數(shù)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第10天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。第10天洗出完整植株，快速擦干，稱得鮮質(zhì)量，并測(cè)量苗髙與根長(zhǎng)。將棉苗放入烘箱以80 ℃烘干至恒重，然后稱得干質(zhì)量，記錄并統(tǒng)計(jì)所得數(shù)據(jù)。

1.2.2脯氨酸含量的測(cè)定

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在分析天平上精確稱取25 mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中含脯氨酸100 μg/mL；取6個(gè)50 mL容量瓶，分別盛入脯氨酸原液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸含量分別為1、2、3、4、5、6 μg/mL。取6支試管，分別吸取2 mL系列標(biāo)準(zhǔn)含量的脯氨酸溶液及2 mL冰醋酸和 2 mL 酸性茚三酮溶液，每支試管在沸水浴中加熱30 min；冷卻后，各試管中準(zhǔn)確加入4 mL甲苯，振蕩30 s，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液；用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，于520 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。先求出吸光度（y）依脯氨酸含量（x）變化而變化的回歸方程，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算2 mL待測(cè)液中脯氨酸的含量。

1.2.2.2樣品的測(cè)定（1）脯氨酸的提取。待棉花幼苗長(zhǎng)出2～3張真葉時(shí)取葉片，并測(cè)定各處理葉片中的脯氨酸含量。準(zhǔn)確稱取不同處理的待測(cè)棉花真葉葉片各0.5 g，分別置于大管中，然后向各管中分別加入5 mL 3%磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取 10 min （提取過(guò)程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后過(guò)濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。（2）吸取 2 mL 提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30 min，溶液即呈紅色。冷卻后加入 4 mL 甲苯，搖蕩30 s，靜置片刻，取上層液至10 mL離心管中，在3 000 r/min下離心5 min。（3）用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)在520 nm波長(zhǎng)處比色，求得吸光度。

1.2.2.3結(jié)果計(jì)算根據(jù)回歸方程計(jì)算出（或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出）2 mL測(cè)定液中脯氨酸質(zhì)量（x），然后計(jì)算干樣品中脯氨酸含量：脯氨酸含量（μg/g）=52x/樣品質(zhì)量（g）。

2結(jié)果與分析

2.1氨基酸浸種對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗生理性狀的影響

2.1.1氨基酸浸種對(duì)NaCl脅迫下棉籽發(fā)芽的影響由圖1可以看出，NaCl處理的棉籽發(fā)芽率明顯低于水處理，而不同種類、同種類不同濃度的氨基酸浸種對(duì)棉籽的發(fā)芽率也有一定的影響。用3種濃度氨基酸浸種后的棉籽發(fā)芽率均低于水處理，所有濃度精氨酸處理的棉籽發(fā)芽率均低于NaCl處理，8 mmol/L 瓜氨酸處理比NaCl處理略高一些，2、6 mmol/L鳥(niǎo)氨酸處理的棉籽發(fā)芽率高于NaCl處理。由此可知，在1 mol/L NaCl脅迫下，用瓜氨酸和鳥(niǎo)氨酸浸種對(duì)棉籽具有一定的緩解作用，而精氨酸對(duì)棉籽的緩解作用較小。

由圖2可以看出，NaCl處理棉籽的發(fā)芽勢(shì)明顯低于水處理，而精氨酸處理的棉籽發(fā)芽勢(shì)均比NaCl處理低，鳥(niǎo)氨酸處理的棉籽發(fā)芽勢(shì)基本都高于NaCl處理，瓜氨酸處理的棉籽發(fā)芽勢(shì)只有在濃度為8 mmol/L時(shí)才高于NaCl處理。由此可知，用不同種類、不同濃度的氨基酸浸種對(duì)NaCl脅迫下的棉籽發(fā)芽勢(shì)影響不同，經(jīng)鳥(niǎo)氨酸浸種處理后的棉籽發(fā)芽勢(shì)較高，而經(jīng)精氨酸浸種的棉籽發(fā)芽勢(shì)較NaCl處理低，說(shuō)明精氨酸緩解鹽脅迫的作用并不明顯。

2.1.2氨基酸浸種對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗生長(zhǎng)的影響由表1可知，精氨酸處理組中，水對(duì)照，2、4 mmol/L精氨酸處理的棉花苗高與NaCl處理差異顯著，6、8 mmol/L精氨酸與NaCl處理差異不顯著；瓜氨酸處理組中，水處理與6 mmol/L瓜氨酸處理苗高差異顯著，與其他濃度處理差異不顯著；鳥(niǎo)氨酸處理中除濃度為4 mmol/L的棉花外，其他處理的棉花苗均比NaCl處理高，與水處理和NaCl處理苗高差異不顯著。

從表1還可以看出，精氨酸處理的棉花根長(zhǎng)均比NaCl處理的短，均與水處理差異顯著，只有4、6 mmol/L精氨酸處理的棉花根長(zhǎng)與NaCl處理差異顯著。瓜氨酸處理的根長(zhǎng)均與水處理差異顯著；只有6 mmol/L瓜氨酸處理的根長(zhǎng)比NaCl處理短且差異顯著，其他處理的根長(zhǎng)均大于NaCl處理但差異不顯著。鳥(niǎo)氨酸處理中只有濃度為2 mmol/L處理的棉花根長(zhǎng)大于NaCl處理，與水處理和NaCl處理差異均不顯著；其他處理均與水處理和NaCl處理差異顯著。

3結(jié)論與討論

一般認(rèn)為，棉花耐鹽能力在萌發(fā)出苗階段最弱，隨著生育進(jìn)程的進(jìn)行不斷增強(qiáng)。在沿海灘涂地區(qū)，成苗難是棉花生產(chǎn)上尚未解決而亟待解決的問(wèn)題。由于棉花幼苗對(duì)鹽分比較敏感，因此根系發(fā)育的好壞影響根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，對(duì)棉苗的耐鹽性尤其重要[13-14]。有研究認(rèn)為，鹽脅迫可以增加根系分泌物中氨基酸的種類和含量。隨著鹽脅迫濃度的增大和黃瓜生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）檢出的化合物種類和總含量呈減少的趨勢(shì)[15]。

本研究結(jié)果表明，在相同濃度NaCl脅迫下，有幾個(gè)濃度的氨基酸浸種處理后使棉花幼苗根長(zhǎng)略大于NaCl處理，但其他幾個(gè)濃度處理的根長(zhǎng)甚至有遠(yuǎn)小于NaCl處理棉花根長(zhǎng)的現(xiàn)象。由此推測(cè)，棉花根部存在一個(gè)耐NaCl閾值，當(dāng)土壤中NaCl濃度在閾值范圍內(nèi)時(shí)，棉花根長(zhǎng)與土壤NaCl濃度呈正比關(guān)系；當(dāng)超出閾值時(shí)，棉花根部會(huì)因受NaCl脅迫而受到影響，從而根長(zhǎng)減小，而不同種類、不同濃度的氨基酸處理可以不同程度提高耐鹽閾值。這個(gè)推測(cè)是否成立，尚待論證。

同時(shí)，在對(duì)本研究中所得各組棉花葉片的脯氨酸含量進(jìn)行分析以及與預(yù)期結(jié)果進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，氨基酸浸種并未很大程度地提升NaCl脅迫下棉花幼苗中的脯氨酸含量，甚至經(jīng)氨基酸浸種后棉花葉片中脯氨酸含量少于NaCl處理。有大量研究表明，脯氨酸的大量積累是高等植物受NaCl脅迫等滲透脅迫時(shí)的正常生理生化現(xiàn)象，因?yàn)樵跐B透脅迫下，脯氨酸既作為滲透調(diào)節(jié)劑維持低水勢(shì)，又保護(hù)生物大分子不受NaCl離子的毒害[16]。本研究中脯氨酸在經(jīng)氨基酸浸種后的生成會(huì)受到抑制，是因?yàn)楦彼岬纳芍饕?個(gè)途徑：谷氨酸途徑和鳥(niǎo)氨酸途徑，而鳥(niǎo)氨酸又可與精氨酸、瓜氨酸形成一個(gè)循環(huán)途徑[17]。由此可知，當(dāng)棉花受到鹽脅迫時(shí)，其體內(nèi)會(huì)生成大量脯氨酸以保證自己的正常生長(zhǎng)發(fā)育，然而當(dāng)對(duì)其以精氨酸、鳥(niǎo)氨酸或瓜氨酸進(jìn)行處理后，合成脯氨酸的重要途徑——鳥(niǎo)氨酸途徑會(huì)受到抑制，從而使脯氨酸的合成受到抑制，最終使其脯氨酸含量小于NaCl脅迫下未經(jīng)氨基酸處理的棉花。

本試驗(yàn)從棉籽萌發(fā)、棉花幼苗生長(zhǎng)及棉花葉片中脯氨酸的含量幾個(gè)方面比較了經(jīng)氨基酸浸種與未經(jīng)氨基酸浸種的棉花受NaCl脅迫時(shí)的差異，從而發(fā)現(xiàn)不同濃度的瓜氨酸、鳥(niǎo)氨酸、精氨酸對(duì)緩解棉花NaCl脅迫的作用不同?？偟膩?lái)說(shuō)，部分種類、部分濃度的氨基酸能緩解NaCl脅迫對(duì)棉籽萌發(fā)及棉花幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，精氨酸、瓜氨酸、鳥(niǎo)氨酸浸種對(duì)棉花植株中脯氨酸的生成有不同程度的抑制作用。

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