李萍　彭昕

[摘要] 目的 探討三葉青提取物對體外培養(yǎng)的人宮頸癌Hela細胞誘導凋亡的作用。 方法 四氮噻唑藍（MTT）法檢測三葉青提取物對Hela細胞的抑制增殖作用及其時效、量效關系；倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。結果 隨著三葉青提取物濃度升高，作用時間的延長，其對Hela細胞的增殖抑制率逐漸增強，與對照組比較有明顯差異（P<0.05），Hela細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的凋亡特征性改變。 結論 三葉青提取物對人宮頸癌Hela 細胞具有明顯的體外細胞毒作用，其毒性作用與藥物的濃度和作用時間呈明顯正相關。

[關鍵詞] 三葉青；Hela細胞；誘導凋亡；MTT法

[中圖分類號] R73-36； R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）23-0004-03

[Abstract] Objective To study the effect of extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg on the proliferation of human cervical cancer Hela cells. Methods MTT assay was used to determine the inhibitory rate of the extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg on the proliferation of HeLa cells. The morphology of cell apoptosis was observed by inverted microscope. Results The inhibition ratio of tumor cell was gradually increased with the longer extension time or the increase of dosages of the extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg the treatment groups was significant differentce（P<0.05） compared with the control group. Under inverted microscope， the tumor cells showed a special phenomenon of cellular apoptosis. Conclusion The extracts of tetrastigma hemsleyanum diels et gilg has a significant toxicological effect on human cervical cancer Hela cells， which positively relates with its concentration and effect time.

[Key words] Tetrastigma hemsleyanum diels et gilg； Hela cells； Apoptosis-inducing； MTT assay

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤， 發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位[1]。目前臨床治療使用的化療藥物多有較強的毒副作用和耐藥性問題，從傳統(tǒng)中藥中尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物新藥開發(fā)的熱門課題[2]。三葉青是我國浙江、江西、廣西等少部分地區(qū)獨有的珍稀中藥品種[3]，可用于治療肝炎、風濕性關節(jié)炎及病毒性腦膜炎等多種疾病，也是抗腫瘤常用藥物[4，5]。有研究發(fā)現(xiàn)三葉青總黃酮能顯著地抑制肝癌、肺癌、結腸癌等多種腫瘤細胞的生長，且細胞有明顯的凋亡特征性改變[6-9]。本研究主要探討三葉青提取物對宮頸癌Hela細胞的體外細胞毒作用，為其臨床應用于宮頸癌治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

MTT 購于Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清購于Gibco公司；HF/60W二氧化碳培養(yǎng)箱，由香港Hecnforce公司生產(chǎn)；OLYMPUS（IX50-S8F2）倒置顯微鏡，酶標儀（型號XMARK）由美國BIO-RAD生產(chǎn)。

1.2 三葉青提取物制備

三葉青藥材購自寧波鄞州醫(yī)藥藥材公司，稱取三葉青藥材1000 g，采用堿性稀醇浸提，酸化沉淀法[9]得三葉青提取物6.9 g。

1.3細胞株及細胞培養(yǎng)

人宮頸癌Hela細胞株購自上海中科院細胞生化所，接種于含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100 mg/L的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃飽和濕度，含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當Hela細胞長滿瓶壁80%以上時，加入0.25%的胰蛋白酶消化，制成1×105/mL細胞懸液。

1.4實驗分組及藥物處理

實驗分為加藥組和對照組（不含藥物，加等體積培養(yǎng)液），加藥組每孔加入不同濃度的三葉青提取物，終濃度分別為1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL、16 mg/mL，每組5個復孔。

1.5 四氮噻唑藍（MTT）比色法

根據(jù)參考文獻[10，11]方法取對數(shù)生長期Hela細胞，接種于96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后，加入各濃度的藥液100 μL。對照組加100 μL的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h或48 h后，棄上清液，在各孔中加入向每孔加入MTT儲液50 μL（5 mg/mL），震蕩混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h小心吸除各孔培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩器上震蕩溶解10 min，空白調(diào)零，用酶標儀測波長570 nm處各孔吸光度，按公式細胞增殖抑制率（IR）=（1-A 加藥組的平均值/A對照組的平均值）×100%計算出細胞增殖抑制率。

1.6光學顯微鏡下形態(tài)學觀察

取處于對數(shù)生長期的Hela細胞，5個不同濃度藥物（同MTT）分別處理，并設不加藥物只加等量培養(yǎng)液的為對照組細胞，分別于倒置顯微鏡下觀察細胞并照相，比較加藥組和對照組Hela細胞的形態(tài)變化。

1.7統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間及組內(nèi)比較采用方差分析（F檢驗），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1細胞增殖抑制率結果及方差分析

由表1可見隨著三葉青提取物濃度的增大，處理時間的延長，Hela細胞OD值逐漸減少，表明其對Hela細胞生長的抑制作用隨著濃度的增大，處理時間的增加而加強。與對照組比較，除了1mg/mL藥物處理24 h組外，其他各藥物處理組的OD值均顯著低于對照組（P<0.05）。表明三葉青提取物濃度本實驗所采用的濃度范圍之內(nèi)對Hela細胞的抑制作用有明顯的劑量及時間依賴。經(jīng)不同濃度三葉青提取物作用后的各組Hela細胞，細胞增殖抑制率結果及方差分析結果如表2、3所示。

3 討論

宮頸癌是危害女性健康的生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，每年全球約有20多萬女性死于宮頸癌。目前臨床多采用以手術和放療為主、化療為輔的治療方案，但常規(guī)放化療對肝、腎等器官的毒副作用大，且易產(chǎn)生多藥耐藥性，治療效果不盡如人意[13]。尋找療效好同時毒副作用較小的天然藥物有重要的臨床意義。近年來中藥誘導凋亡已成為腫瘤研究領域的一個新熱點，不少學者以體外細胞株為研究對象發(fā)現(xiàn)中藥可通過影響細胞周期、改變細胞凋亡基因及蛋白的表達或相關酶的活性等途徑來有效抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡[14]。三葉青為浙江省地方性傳統(tǒng)中藥，最近因其被發(fā)現(xiàn)具有抗多種腫瘤的生物活性而被廣泛關注。有報道顯示[15]，三葉青提取物與肺癌 A549細胞共培養(yǎng)48 h，其細胞活性顯著性降低，且DNA 瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)“梯狀”條帶，是細胞凋亡的一個重要標志。汪珍等[8]觀察三葉青提取物對人結腸癌RKO細胞的影響，結果顯示：三葉青提取物能顯著地抑制人結腸癌細胞系RKO細胞的生長，并能下調(diào) Bcl-XL、上調(diào)Bid來誘導凋亡，具有濃度依賴性。馮正權等[16]通過體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細胞，檢測三葉青黃酮對其生長的抑制作用，結果表明：三葉青黃酮能顯著抑制 SGC-7901細胞增殖，具有濃度依賴性，且細胞周期分析顯示有明顯的凋亡峰出現(xiàn)，并能降低細胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶-2的含量。此外，三葉青提取物能夠改善荷瘤小鼠機體的細胞免疫功能，激活機體的抗氧化作用途徑，具有一定的體內(nèi)抑瘤效果，其高劑量干預后的抑瘤率達 36.06%[17]。

本研究通過定量（MTT）和定性（顯微鏡觀測）的方法，對5種不同濃度的三葉青的提取物作用后的Hela細胞凋亡特征性改變進行了研究，發(fā)現(xiàn)實驗所采用濃度范圍內(nèi)三葉青提取物均有抑制Hela細胞增殖作用，且呈濃度/時間-效應正相關。關于增殖抑制率的評價一般認為[1]，<30%為不敏感（耐藥），>50%為敏感，30%～50%為中度敏感，由本實驗檢測結果可知，8 mg/mL的三葉青提取物作用24 h后對Hela細胞的生長即有中度敏感的抑制作用（36.85%），且隨其濃度的增加及作用時間的延長越敏感。通過光學顯微鏡觀察Hela細胞形態(tài)，可見細胞變圓、細胞核固縮、核碎裂及凋亡小體形成等凋亡形態(tài)，隨著濃度的增加該特征越明顯。因此，本研究結果顯示三葉青提取物對Hela細胞具有很好的腫瘤細胞毒作用，是很有潛力的抗宮頸癌藥物。但本研究中的方法僅為初步觀察細胞凋亡的指標[18]，本課題組擬進一步通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測法定性分析凋亡細胞的DNA裂解，通過流式細胞儀定量分析三葉青作用后的細胞凋亡率及其細胞周期改變，并檢測三葉青提取物作用后凋亡相關基因表達的改變以明確其促凋亡的分子機制，為開發(fā)研制宮頸癌治療的新候選藥物進一步提供可靠的理論和試驗依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 張麗云. 柴胡、苦參、大黃、黃柏對人宮頸癌細胞抑制效果的研究[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學院，2011.

[2] 戴焱焱，黃才國，陳若華. 天然提取物誘導人 HepG2 細胞凋亡的研究進展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，12（20）：3962-3965.

[3] 韋樹根，董青松，韋瑩，等. 廣西瀕危珍稀中藥材三葉青資源調(diào)查研究[J]. 北方園藝，2011，21：162-164.

[4] 彭昕，張劍，何軍邀，等. 三葉青松散型和致密型愈傷組織懸浮培養(yǎng)及黃酮積累的比較研究[J]. 中草藥，2012， 43（3）：577-580.

[5] 彭昕，汪榮斌，何軍邀，等. 三葉青顆粒狀愈傷組織懸浮培養(yǎng)系的建立及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 中成藥，2012，34（5）：961-964.

[6] 張立明，樊瑞軍，楊鳳琴. 三葉青黃酮誘導SMMC-7721肝癌細胞凋亡的實驗研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21（11）：2850-2851.

[7] 劉躍銀，夏紅. 三葉青乙酸乙酯提取物誘導人結腸癌 HT-29 細胞凋亡[J]. 湖南師范大學學報（醫(yī)學版），2010，7（4）：22-28.

[8] 汪珍，馮健，王曉華. 三葉青提取物對人結腸癌細胞系RKO細胞凋亡的影響[J]. 浙江中醫(yī)藥大學學報，2008， 32（3）：321-323.

[9] 王小莉，曾娟，周輝. 三葉青提取物對肺癌細胞株A549的影響[J]. 腫瘤藥學，2012，2（5）：347-349.

[10] 劉旭. 虎眼萬年青總皂苷對乳腺癌細胞增殖與凋亡的影響及機制研究[D]. 南京中醫(yī)藥大學，2012.

[11] 徐吉敏，張世安，黃艷. MTT法研究酸棗仁皂苷A對肝細胞——肝星狀細胞和肝癌細胞增殖的影響[J]. 西北藥學雜志，2013，28（3）：281-284.

[12] 劉秀萍. 丹參制劑對宮頸癌Hela細胞生長增殖及其相關調(diào)控分子表達影響的體外實驗研究[D]. 河北醫(yī)科大學，2010.

[13] 陳秀瑋. 白樺脂酸誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡及機制的研究[D]. 黑龍江中醫(yī)藥大學，2012.

[14] 康麗娜. 中藥誘導腫瘤細胞凋亡研究進展[J]. 醫(yī)學信息，2011，7：3168-3169.

[15] 程偉，陸曙梅. 三葉青提取物對肺癌 A549 細胞的體外抑制作用[J]. 中國實驗方劑學雜志，2007，13 （10）：53-56.

[16] 馮正權，倪克鋒，何煜，等. 三葉青黃酮誘導 SGC-7901胃癌細胞凋亡的實驗研究[J]. 中國臨床藥理學與治療學，2006，11（6）：669-672.

[17] 徐彩菊，白寧寧，孟佳，等. 三葉青提取物體內(nèi)抑瘤作用及其機理研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19（2）：278-280.

[18] 張廣智，胡長敏，陳穎鈺，等. 細胞凋亡的主要檢測方法研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展，2011，32（8）：89-92.

（收稿日期：2014-02-27）

1.6光學顯微鏡下形態(tài)學觀察

取處于對數(shù)生長期的Hela細胞，5個不同濃度藥物（同MTT）分別處理，并設不加藥物只加等量培養(yǎng)液的為對照組細胞，分別于倒置顯微鏡下觀察細胞并照相，比較加藥組和對照組Hela細胞的形態(tài)變化。

1.7統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間及組內(nèi)比較采用方差分析（F檢驗），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1細胞增殖抑制率結果及方差分析

由表1可見隨著三葉青提取物濃度的增大，處理時間的延長，Hela細胞OD值逐漸減少，表明其對Hela細胞生長的抑制作用隨著濃度的增大，處理時間的增加而加強。與對照組比較，除了1mg/mL藥物處理24 h組外，其他各藥物處理組的OD值均顯著低于對照組（P<0.05）。表明三葉青提取物濃度本實驗所采用的濃度范圍之內(nèi)對Hela細胞的抑制作用有明顯的劑量及時間依賴。經(jīng)不同濃度三葉青提取物作用后的各組Hela細胞，細胞增殖抑制率結果及方差分析結果如表2、3所示。

3 討論

宮頸癌是危害女性健康的生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，每年全球約有20多萬女性死于宮頸癌。目前臨床多采用以手術和放療為主、化療為輔的治療方案，但常規(guī)放化療對肝、腎等器官的毒副作用大，且易產(chǎn)生多藥耐藥性，治療效果不盡如人意[13]。尋找療效好同時毒副作用較小的天然藥物有重要的臨床意義。近年來中藥誘導凋亡已成為腫瘤研究領域的一個新熱點，不少學者以體外細胞株為研究對象發(fā)現(xiàn)中藥可通過影響細胞周期、改變細胞凋亡基因及蛋白的表達或相關酶的活性等途徑來有效抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡[14]。三葉青為浙江省地方性傳統(tǒng)中藥，最近因其被發(fā)現(xiàn)具有抗多種腫瘤的生物活性而被廣泛關注。有報道顯示[15]，三葉青提取物與肺癌 A549細胞共培養(yǎng)48 h，其細胞活性顯著性降低，且DNA 瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)“梯狀”條帶，是細胞凋亡的一個重要標志。汪珍等[8]觀察三葉青提取物對人結腸癌RKO細胞的影響，結果顯示：三葉青提取物能顯著地抑制人結腸癌細胞系RKO細胞的生長，并能下調(diào) Bcl-XL、上調(diào)Bid來誘導凋亡，具有濃度依賴性。馮正權等[16]通過體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細胞，檢測三葉青黃酮對其生長的抑制作用，結果表明：三葉青黃酮能顯著抑制 SGC-7901細胞增殖，具有濃度依賴性，且細胞周期分析顯示有明顯的凋亡峰出現(xiàn)，并能降低細胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶-2的含量。此外，三葉青提取物能夠改善荷瘤小鼠機體的細胞免疫功能，激活機體的抗氧化作用途徑，具有一定的體內(nèi)抑瘤效果，其高劑量干預后的抑瘤率達 36.06%[17]。

本研究通過定量（MTT）和定性（顯微鏡觀測）的方法，對5種不同濃度的三葉青的提取物作用后的Hela細胞凋亡特征性改變進行了研究，發(fā)現(xiàn)實驗所采用濃度范圍內(nèi)三葉青提取物均有抑制Hela細胞增殖作用，且呈濃度/時間-效應正相關。關于增殖抑制率的評價一般認為[1]，<30%為不敏感（耐藥），>50%為敏感，30%～50%為中度敏感，由本實驗檢測結果可知，8 mg/mL的三葉青提取物作用24 h后對Hela細胞的生長即有中度敏感的抑制作用（36.85%），且隨其濃度的增加及作用時間的延長越敏感。通過光學顯微鏡觀察Hela細胞形態(tài)，可見細胞變圓、細胞核固縮、核碎裂及凋亡小體形成等凋亡形態(tài)，隨著濃度的增加該特征越明顯。因此，本研究結果顯示三葉青提取物對Hela細胞具有很好的腫瘤細胞毒作用，是很有潛力的抗宮頸癌藥物。但本研究中的方法僅為初步觀察細胞凋亡的指標[18]，本課題組擬進一步通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測法定性分析凋亡細胞的DNA裂解，通過流式細胞儀定量分析三葉青作用后的細胞凋亡率及其細胞周期改變，并檢測三葉青提取物作用后凋亡相關基因表達的改變以明確其促凋亡的分子機制，為開發(fā)研制宮頸癌治療的新候選藥物進一步提供可靠的理論和試驗依據(jù)。

[參考文獻]

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[4] 彭昕，張劍，何軍邀，等. 三葉青松散型和致密型愈傷組織懸浮培養(yǎng)及黃酮積累的比較研究[J]. 中草藥，2012， 43（3）：577-580.

[5] 彭昕，汪榮斌，何軍邀，等. 三葉青顆粒狀愈傷組織懸浮培養(yǎng)系的建立及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 中成藥，2012，34（5）：961-964.

[6] 張立明，樊瑞軍，楊鳳琴. 三葉青黃酮誘導SMMC-7721肝癌細胞凋亡的實驗研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21（11）：2850-2851.

[7] 劉躍銀，夏紅. 三葉青乙酸乙酯提取物誘導人結腸癌 HT-29 細胞凋亡[J]. 湖南師范大學學報（醫(yī)學版），2010，7（4）：22-28.

[8] 汪珍，馮健，王曉華. 三葉青提取物對人結腸癌細胞系RKO細胞凋亡的影響[J]. 浙江中醫(yī)藥大學學報，2008， 32（3）：321-323.

[9] 王小莉，曾娟，周輝. 三葉青提取物對肺癌細胞株A549的影響[J]. 腫瘤藥學，2012，2（5）：347-349.

[10] 劉旭. 虎眼萬年青總皂苷對乳腺癌細胞增殖與凋亡的影響及機制研究[D]. 南京中醫(yī)藥大學，2012.

[11] 徐吉敏，張世安，黃艷. MTT法研究酸棗仁皂苷A對肝細胞——肝星狀細胞和肝癌細胞增殖的影響[J]. 西北藥學雜志，2013，28（3）：281-284.

[12] 劉秀萍. 丹參制劑對宮頸癌Hela細胞生長增殖及其相關調(diào)控分子表達影響的體外實驗研究[D]. 河北醫(yī)科大學，2010.

[13] 陳秀瑋. 白樺脂酸誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡及機制的研究[D]. 黑龍江中醫(yī)藥大學，2012.

[14] 康麗娜. 中藥誘導腫瘤細胞凋亡研究進展[J]. 醫(yī)學信息，2011，7：3168-3169.

[15] 程偉，陸曙梅. 三葉青提取物對肺癌 A549 細胞的體外抑制作用[J]. 中國實驗方劑學雜志，2007，13 （10）：53-56.

[16] 馮正權，倪克鋒，何煜，等. 三葉青黃酮誘導 SGC-7901胃癌細胞凋亡的實驗研究[J]. 中國臨床藥理學與治療學，2006，11（6）：669-672.

[17] 徐彩菊，白寧寧，孟佳，等. 三葉青提取物體內(nèi)抑瘤作用及其機理研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19（2）：278-280.

[18] 張廣智，胡長敏，陳穎鈺，等. 細胞凋亡的主要檢測方法研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展，2011，32（8）：89-92.

（收稿日期：2014-02-27）

1.6光學顯微鏡下形態(tài)學觀察

取處于對數(shù)生長期的Hela細胞，5個不同濃度藥物（同MTT）分別處理，并設不加藥物只加等量培養(yǎng)液的為對照組細胞，分別于倒置顯微鏡下觀察細胞并照相，比較加藥組和對照組Hela細胞的形態(tài)變化。

1.7統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間及組內(nèi)比較采用方差分析（F檢驗），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1細胞增殖抑制率結果及方差分析

由表1可見隨著三葉青提取物濃度的增大，處理時間的延長，Hela細胞OD值逐漸減少，表明其對Hela細胞生長的抑制作用隨著濃度的增大，處理時間的增加而加強。與對照組比較，除了1mg/mL藥物處理24 h組外，其他各藥物處理組的OD值均顯著低于對照組（P<0.05）。表明三葉青提取物濃度本實驗所采用的濃度范圍之內(nèi)對Hela細胞的抑制作用有明顯的劑量及時間依賴。經(jīng)不同濃度三葉青提取物作用后的各組Hela細胞，細胞增殖抑制率結果及方差分析結果如表2、3所示。

3 討論

宮頸癌是危害女性健康的生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，每年全球約有20多萬女性死于宮頸癌。目前臨床多采用以手術和放療為主、化療為輔的治療方案，但常規(guī)放化療對肝、腎等器官的毒副作用大，且易產(chǎn)生多藥耐藥性，治療效果不盡如人意[13]。尋找療效好同時毒副作用較小的天然藥物有重要的臨床意義。近年來中藥誘導凋亡已成為腫瘤研究領域的一個新熱點，不少學者以體外細胞株為研究對象發(fā)現(xiàn)中藥可通過影響細胞周期、改變細胞凋亡基因及蛋白的表達或相關酶的活性等途徑來有效抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡[14]。三葉青為浙江省地方性傳統(tǒng)中藥，最近因其被發(fā)現(xiàn)具有抗多種腫瘤的生物活性而被廣泛關注。有報道顯示[15]，三葉青提取物與肺癌 A549細胞共培養(yǎng)48 h，其細胞活性顯著性降低，且DNA 瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)“梯狀”條帶，是細胞凋亡的一個重要標志。汪珍等[8]觀察三葉青提取物對人結腸癌RKO細胞的影響，結果顯示：三葉青提取物能顯著地抑制人結腸癌細胞系RKO細胞的生長，并能下調(diào) Bcl-XL、上調(diào)Bid來誘導凋亡，具有濃度依賴性。馮正權等[16]通過體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細胞，檢測三葉青黃酮對其生長的抑制作用，結果表明：三葉青黃酮能顯著抑制 SGC-7901細胞增殖，具有濃度依賴性，且細胞周期分析顯示有明顯的凋亡峰出現(xiàn)，并能降低細胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶-2的含量。此外，三葉青提取物能夠改善荷瘤小鼠機體的細胞免疫功能，激活機體的抗氧化作用途徑，具有一定的體內(nèi)抑瘤效果，其高劑量干預后的抑瘤率達 36.06%[17]。

本研究通過定量（MTT）和定性（顯微鏡觀測）的方法，對5種不同濃度的三葉青的提取物作用后的Hela細胞凋亡特征性改變進行了研究，發(fā)現(xiàn)實驗所采用濃度范圍內(nèi)三葉青提取物均有抑制Hela細胞增殖作用，且呈濃度/時間-效應正相關。關于增殖抑制率的評價一般認為[1]，<30%為不敏感（耐藥），>50%為敏感，30%～50%為中度敏感，由本實驗檢測結果可知，8 mg/mL的三葉青提取物作用24 h后對Hela細胞的生長即有中度敏感的抑制作用（36.85%），且隨其濃度的增加及作用時間的延長越敏感。通過光學顯微鏡觀察Hela細胞形態(tài)，可見細胞變圓、細胞核固縮、核碎裂及凋亡小體形成等凋亡形態(tài)，隨著濃度的增加該特征越明顯。因此，本研究結果顯示三葉青提取物對Hela細胞具有很好的腫瘤細胞毒作用，是很有潛力的抗宮頸癌藥物。但本研究中的方法僅為初步觀察細胞凋亡的指標[18]，本課題組擬進一步通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測法定性分析凋亡細胞的DNA裂解，通過流式細胞儀定量分析三葉青作用后的細胞凋亡率及其細胞周期改變，并檢測三葉青提取物作用后凋亡相關基因表達的改變以明確其促凋亡的分子機制，為開發(fā)研制宮頸癌治療的新候選藥物進一步提供可靠的理論和試驗依據(jù)。

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（收稿日期：2014-02-27）