楊 軍,王連新,季 驪,周 健,倪立新

(江蘇省啟東市人民醫(yī)院 啟東肝癌研究所,江蘇 啟東,226200)

肝細胞癌(HCC)在全球范圍內發(fā)病率和死亡率分別占惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第5位和第3位[1],在中國是惡性腫瘤的第2位死因[2],是臨床常見的惡性腫瘤之一，其手術后的高復發(fā)轉移率是HCC患者死亡率居高不下的最主要原因[3]。HCC的復發(fā)和轉移有賴于腫瘤新生血管的生長以供應營養(yǎng)[4]。目前，對肝細胞肝癌中血管生發(fā)的研究及作用機制的探索已成為一個熱點[5]。血管內皮生長因子(VEGF)在腫瘤的生長、播散及轉移過程中起著著極為重要的作用，可誘導腫瘤血管分化及形成，是參與血管生發(fā)和成熟的最重要的條件之一[6]。Delta-Notch信號通路尤其是其配體DLL4(Delta樣配體4)被認為是調節(jié)腫瘤血管生發(fā)和成熟的另一個重要條件，使腫瘤血管的功能和結構得以優(yōu)化，更有利于為腫瘤組織運輸營養(yǎng)物質，且DLL4與VEFG相互影響形成反饋作用。本研究測定肝細胞肝癌組織中VEGF和DLL4的表達量，分析與肝細胞肝癌臨床病理分期的關系及其臨床意義，擬為肝細胞肝癌的抗血管生成靶向治療提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 病理及組織標本

收集啟東市人民醫(yī)院、啟東肝癌研究所外科2010年1月— 2013年6月手術切除并經病理證實的肝細胞肝癌組織石蠟標本75例，全部病例術前均未接受肝動脈介入栓塞等治療。其中男46例，女29例，年齡35～72歲，中位年齡53歲,<60歲48例,≥60歲27例。

1.2 主要試劑及方法

兔抗人DLL4 多克隆抗體(Abcam公司)、兔抗人VEGF單克隆抗體(北京中杉金橋生物有限公司)、SP免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)。染色步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為空白對照。

1.3 結果判定

所有的標本均通過2位病理醫(yī)師進行評判。VEGF、DLL4以細胞質或細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性染色。根據染色強度及陽性細胞比例進行評分。隨機觀察5個高倍鏡視野，計數500個細胞，根據染色的細胞數目<5%為(-),5%～25%為(+),25%～50%為(2+)，50%～75%為(3+)，>75%為(4+)。(2+)及以上為陽性表達，用以計算陽性率。

1.4 統計與分析

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。采用χ2檢驗分析VEGF和DLL4在各臨床病理數據中的表達情況。VEGF與DLL4表達的相關性采用Spearman等級相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 VEGF、DLL4在肝細胞癌及癌旁組織中的表達

75例肝細胞癌標本中，VEGF陽性顆粒主要定位于腫瘤細胞質,DLL4陽性顆粒主要定位于腫瘤細胞質和細胞膜，二者顆粒均呈棕黃色。在肝細胞肝癌組織中VEGF蛋白的陽性表達率為 64.0%(48/75),顯著高于對照組的13.3%(4/30),差異有統計學意義(P<0.01)。DLL4蛋白在肝細胞肝癌組織中的陽性表達率為81.3%(61/75),顯著高于對照組的23.3%(7/30),差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1、圖2、表1。

圖1 VEGF在肝細胞肝癌中的陽性表達 (SP 400倍)

圖2 DLL4在肝細胞肝癌中的陽性表達 (SP 400倍)

2.2 VEGF及DLL4在肝細胞癌中的表達與臨床病理參數之間的差異

VEGF及DLL4蛋白在肝細胞肝癌中表達與腫瘤結節(jié)數目(P<0.05)、脈管浸潤(P<0.01)有關，各臨床病理參數分組間差異有統計學意義(P<0.05); 而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、是否肝硬化、有無腫瘤包膜、腫瘤分化程度無關，各臨床病理參數分組間的差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 VEGF和DLL4在肝細胞肝癌及癌旁肝組織中的表達情況[n(%)]

2.3 在肝細胞肝癌組織中表達的相關性

VEGF和DLL4的表達具有顯著一致性，在VEGF陽性表達標本中的DLL4表達率明顯高于VEGF陰性表達的標本,VEGF和DLL4在肝細胞肝癌組織中陽性表達水平呈明顯正相關(r=0.217,P<0.05)。見表3。

表2 VEGF和DLL4的表達與各腫瘤臨床病理參數之間的關系[n(%)]

表3 肝細胞肝癌中VEGF和DLL4表達的相關性

3 討 論

肝細胞肝癌是死亡率較高的惡性腫瘤之一，其生長與血管生成密切關系，豐富的腫瘤血管為其生長提供充分的營養(yǎng)支持，為浸潤播散及轉移提供了營養(yǎng)保障。其中VEGF和DLL4-Notch信號通路相互作用，共同調控腫瘤血管生成，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。

VEGF是一種在細胞內合成的肝素結合糖蛋白，與細胞膜上硫酸類肝素蛋白多糖結合位點結合，經過蛋白水解作用后以二聚體形式分泌到細胞外，作用于血管內皮細胞，促進血管，包括腫瘤血管的形成及生長[7]。在腫瘤的生長及發(fā)展過程中，VEGF起著極為重要的作用，可促進腫瘤血管形成來輸送各種營養(yǎng)物質及氧氣，以滿足腫瘤細胞生長需要，在腫瘤組織中有較高表達[6]。VEGF作用于內皮細胞上的特異性受體，促進血管內皮細胞的生成。另外VEGF還有利于腫瘤細胞脫落進入血循環(huán)或向臨近組織擴散，有利于腫瘤的浸潤生長及遠處轉移。本研究結果證實：VEGF蛋白在肝細胞肝癌組織中的陽性表達率明顯高于正常肝細胞肝組織(P<0.01),提示VEGF的異常高表達促進了肝細胞肝癌中的血管生發(fā)，而在正常肝細胞肝組織的VEGF的表達水平并不能起促血管生發(fā)作用。同時，本研究證實VEGF蛋白的表達與肝細胞肝癌腫瘤的結節(jié)數目(P<0.05)、脈管是否浸潤(P<0.01)有關，說明VEGF促進了肝細胞肝癌的浸潤與播散。

Notch信號通路是公認的控制血管發(fā)育和病理血管形成的關鍵信號通路[8],而DLL4(Delta樣配體4)是Notch受體的重要配體之一，其特異性表達于內皮細胞而引起關注。近年來有研究[9]表明,DLL4在膀胱癌細胞中高表達，在侵襲性膀胱癌中DLL4表達升高尤為顯著。隨后體外實驗表明,DLL4不但調控胚胎血管的生成，還調控腫瘤血管的生長，而且影響腫瘤的生長和進展[10]。DLL4起初在胚胎發(fā)育時的動脈內皮細胞中被發(fā)現，隨后研究發(fā)現,DLL4在血管前方的內皮尖端細胞主要表達于細胞膜[11]。本實驗研究結果證實在肝細胞肝癌組織中DLL4蛋白的表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.01),提示DLL4可能參與肝細胞肝癌的病程進展。本實驗還證實,DLL4蛋白的表達與肝細胞肝癌的結節(jié)數目(P<0.05)、脈管是否浸潤(P<0.01)有關，說明DLL4高表達促進肝細胞肝癌的侵襲。

VEGF與DLL4關系密切,DLL4-Notch信號通路受VEGF的調控，而DLL4對VEGF又具有反作用。Ridgway等[12]在一項裸鼠負瘤實驗證實Notch/DLL4信號通路與VEGF之間存在“串話”(cross talk),阻斷DLL4-Notch受體通路能導致大量無功能新生血管形成，這種阻斷對存在耐受VEGF拮抗藥的個體同樣有效。Williams等[13]在血管內皮細胞中發(fā)現，VEGF可誘導尖端細胞表達DLL4,由此假設DLL4是VEGF的下游基因，與其一起作用調控萌發(fā)和分支的形態(tài)。DLL4與VEGF之間有一個負反饋作用，即VEGF上調DLL4的表達，而DLL4可能由其他途徑壓制血管內皮細胞對VEGF刺激的反應。本研究發(fā)現,VEGF和DLL4蛋白的表達呈顯著正相關(r=0.217,P<0.05),說明VEGF與DLL4共同參與肝細胞肝癌的侵襲和轉移。

目前肝細胞癌的血管靶向藥物已應用于臨床，貝伐單抗(Bevacizumab,Avastin)與VEGF單克隆IgG1抗體競爭結合，選擇性地抑制VEGF,抑制新生血管形成。索拉非尼(Sorafenib,多吉美)通過靶向阻斷Ras-Raf-MAPK通路上的Raf激酶，直接抑制腫瘤細胞增殖，同時還可抑制VEGFR-2、VEGFR-3、c-Kit等多種受體，以抑制腫瘤血管生成，起到抗血管生成和抗腫瘤細胞增殖的雙重作用[14],在肝癌的晚期或輔助治療中起了一定的作用。但由于部分HCC患者存在對該藥的耐受，治療效果不甚理想[15-16]。

迄今為止,HCC患者中DLL4與VEGF兩者表達及相互關系的臨床與實驗研究報道不多。本實驗對肝細胞肝癌組織中VEGF和DLL4蛋白水平進行了相關性分析，發(fā)現兩者在肝細胞肝癌中表達水平呈顯著正相關，提示兩者在肝細胞肝癌的生長與擴散中起著協同作用。DLL4-Notch信號通路有望在VEGF之后成為肝細胞肝癌抗血管靶向治療的又一個新靶點，聯合作用于VEGF和DLL4有望增加靶向藥物的療效。

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