曾東，肖拉,2，倪學(xué)勤*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物微生態(tài)研究中心，四川 雅安 625014；2.樂(lè)山市市中區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 樂(lè)山 614000)

建鯉IL–1β和IL–8基因?qū)崟r(shí)熒光定量RT–PCR檢測(cè)方法的建立

曾東1，肖拉1,2，倪學(xué)勤1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物微生態(tài)研究中心，四川 雅安 625014；2.樂(lè)山市市中區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 樂(lè)山 614000)

根據(jù)GenBank上的基因序列，在保守區(qū)設(shè)定并合成特異性引物，選擇β–actin作為內(nèi)參基因，采用SYBR Green I染料法，進(jìn)行熔解曲線分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。熔解曲線表明，β–actin、IL–1β、IL–8的基因產(chǎn)物均為特異性產(chǎn)物，其Tm值分別為86、82.5和84 ℃；標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，各基因Ct值的檢測(cè)范圍為12～32，擴(kuò)增效率分別為96.3%，103.2%和102.6%，具有良好的線性關(guān)系，且r2均大于0.990；組內(nèi)變異系數(shù)分別為0.14%～0.86%，0.18%～0.93%和0.13%～0.86%；用建立的方法檢測(cè)健康建鯉頭、腎組織中IL–1β、IL–8的表達(dá)情況，相對(duì)表達(dá)量分別為1.09和1.71。綜合分析，建立的建鯉IL–1β、IL–8基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法具有檢測(cè)范圍廣，擴(kuò)增效率高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性高的特點(diǎn)，可用于建鯉IL–1β、IL–8基因的表達(dá)測(cè)定。

建鯉；IL–1β；IL–8；實(shí)時(shí)熒光定量RT–PCR

白細(xì)胞介素1β(interleukin–1β，IL–1β)和白細(xì)胞介素8(IL–8)分別作為重要的促炎因子和趨化因子，在硬骨魚(yú)類(Osteichthyes)免疫系統(tǒng)中起著重要的作用[1]。在一般狀況下，細(xì)胞因子的分泌量很低，或處于失活狀態(tài)，但在機(jī)體的免疫細(xì)胞或組織受到刺激發(fā)生新的基因轉(zhuǎn)錄后，其含量將會(huì)大幅度上升，通過(guò)與特殊細(xì)胞表面受體的高親和性結(jié)合，以協(xié)同形式結(jié)合其他細(xì)胞因子或抗病毒分子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2]。

IL–1β和IL–8的基因表達(dá)水平在家畜、禽類及魚(yú)類上經(jīng)常用作機(jī)體免疫力的指示器，對(duì)其活化程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以了解疾病的發(fā)病機(jī)制[1,3–5]。目前國(guó)外對(duì)魚(yú)類基因表達(dá)的研究較多，如 I. E. Mulder等[3]研究感染沙門(mén)氏菌(Salmonella)的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)腸道的IL–1β、IL–8基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們的相對(duì)表達(dá)量均有所降低；S. F. Gonzalez 等[4]對(duì)感染寄生蟲(chóng)的鯉魚(yú)(Cyprinus carpio L.)皮膚的IL–1β基因及D. H. Kim等[5]分別對(duì)益生菌共培養(yǎng)條件下虹鱒頭、腎細(xì)胞中的IL–1β、IL–8等基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)量均升高，說(shuō)明細(xì)胞因子的表達(dá)量會(huì)因?yàn)椴煌碳こ霈F(xiàn)不同程度的升高或降低，調(diào)節(jié)魚(yú)體免疫功能。雖然魚(yú)類 IL–1β、IL–8的免疫功能已有部分報(bào)道[6–8]，但還沒(méi)有系統(tǒng)研究它們的表達(dá)情況。為了更好地評(píng)價(jià)魚(yú)類白細(xì)胞介素的免疫功能，準(zhǔn)確測(cè)定IL–1β和IL–8在組織中的表達(dá)量極其重要，有必要在分子水平上建立一種實(shí)時(shí)、快速、有效的檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)以健康建鯉(Cyprinus carpio var. Jian)為材料，選取β–actin為參考基因，以建立一種快速方便有效的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)魚(yú)

體質(zhì)量約為(50.4±3.8) g的健康建鯉，購(gòu)自四川雅安魚(yú)苗站。

1.1.2 主要儀器和試劑

CFX96實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀、MyCyclerTMThermal Cycler PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)Gel DocXR，均為美國(guó)Bio–Rad公司產(chǎn)品；冷凍高速離心機(jī)，為德國(guó)Thermo fisher公司產(chǎn)品。

天根 DP421 TRNzol A+總 RNA提取試劑；WM5–2302830 Phase Lock Gel Heavy；KR103–04 Quant cDNA第一鏈合成試劑盒；free–DNase/RNase水；2 000 bp DNA Maker；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上建鯉的β–actin、IL–1β、IL–8基因序列，在各自的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1 建鯉β–actin、IL–1β和IL–8基因RT–qPCR擴(kuò)增的引物序列及其產(chǎn)物大小Table 1 Primers used for the RT–qPCR for detection of β–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp

1.2 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

取健康建鯉頭、腎，用生理鹽水沖洗后，在研缽中加入液氮研磨。采用天根DP421 TRNzol A+總RNA提取試劑和 WM5–2302830 Phase Lock Gel Heavy組合提取總RNA。提取的RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。提取到完整的RNA后，用天根KR103–04 Quant cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。所有操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄的cDNA于–20 ℃保存，備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增β–actin、IL–1β、IL–8基因。反應(yīng)體系為25 μL：SYBR Premix Ex TaqTM12.5 Ⅱ μL，上游引物1 μL(25 μmol/L)，下游引物1 μL (25 μmol/L)，cDNA 2 μL，RNase–free 水 8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 變性5 s、62 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸 15 s, 40個(gè)循環(huán)；最后4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用SYBR Green Ⅰ染料法，在CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析，并對(duì)每個(gè)基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR的反應(yīng)條件的退火溫度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒推薦的25 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，RNase– free 水8.5 μL)。采用二步法(95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，Tm下處理30 s，40個(gè)循環(huán))，60 30 s℃ 上升到95 ℃，71個(gè)循環(huán)，獲得熔解曲線。退火溫度的優(yōu)化在引物的(Tm±5) ℃進(jìn)行。引物濃度在0.2～1.0 μmol/L調(diào)整。比較每個(gè)基因在不同溫度和引物濃度下的Ct值、熒光強(qiáng)度及熔解曲線。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋，取10–4～10–10梯度為模板，采用以上優(yōu)化好的條件進(jìn)行SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)平行，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 重復(fù)性檢測(cè)

用建立好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)6尾健康建鯉的頭腎樣品進(jìn)行重復(fù)性檢驗(yàn)，檢測(cè)樣品中β–actin、IL–1β和IL–8基因的Ct值。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。算出Ct平均值，并計(jì)算其變異系數(shù)(CV)。

1.7 健康建鯉頭、腎中IL–1β和IL–8基因的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

用已建立的方法對(duì) 3個(gè)健康建鯉頭腎樣品中IL–1β和IL–8基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。采用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶分析系統(tǒng)(Pfaffl法)進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取效果

提取建鯉頭、腎的總RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果(圖1)顯示，條帶(28S、18S)清晰可見(jiàn)，條帶間無(wú)明顯的拖尾現(xiàn)象，這表明RNA降解少，完整性良好。采用核酸紫外分析儀進(jìn)行檢測(cè)，其OD260 nm/OD280 nm為1.91，說(shuō)明RNA純度較好，符合RT–PCR的要求。

圖1 建鯉頭和腎組織的總RNAFig.1 Total RNA from head kidney of Jian carp

2.2 特異性分析結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量RT–PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析(圖 2)表明，目的條帶長(zhǎng)度符合預(yù)期大小，β–actin為152 bp，IL–1β為114 bp，IL–8為150 bp，且實(shí)時(shí)熒光定量熔解曲線(圖 3)分析結(jié)果均為特異性單峰，無(wú)引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，表明擴(kuò)增的特異性好，產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。β–actin、IL–1β 和IL–8等基因的目的產(chǎn)物的Tm值分別為86、82.5 和84 ℃。

圖2 建鯉β–actin、IL–1β、IL–8基因目的產(chǎn)物的RT–PCR結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of RT–PCR–amplified products forβ–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp

圖3 建鯉β–actin、IL–1β和IL–8目的產(chǎn)物的熔解曲線Fig.3 Melting curve of PCR–amplified products for β–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp

2.3 熒光定量PCR的優(yōu)化結(jié)果

如圖4和圖5所示：采用二步法，退火溫度為62 ℃，引物濃度為0.6 μmol/L時(shí)具有最小Ct值和最強(qiáng)的熒光吸收值。

圖4 不同退火溫度下β–actin、IL–1β和IL–8目的產(chǎn)物的Ct值和熒光吸收值Fig.4 Ct and fluorescence value of PCR–amplified products forβ–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp at different temperatures

圖5 不同引物濃度下β–actin、IL–1β和IL–8目的產(chǎn)物的Ct值和熒光吸收值Fig.5 Ct and fluorescence value of PCR–amplified products for β–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp at different primer concentrations

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 10倍系列稀釋，得到了均勻間距的擴(kuò)增曲線，每個(gè)10倍稀釋的Ct值相差大約3.3，用7個(gè)稀釋度繪制相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表明：β–actin、IL–1β和IL–8基因的Ct值的檢測(cè)范圍約為 12～32，擴(kuò)增效率分別為 96.3%、 103.2%和102.6%，且相關(guān)系數(shù)r2均大于0.990。

圖6 建鯉β–actin、IL–1β和IL–8 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of SYBR Green I RT–qPCR amplified products for β–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp

2.5 穩(wěn)定性

采用已建立的方法，測(cè)定6個(gè)樣品的β–actin、IL–1β和IL–8基因的穩(wěn)定性結(jié)果分別見(jiàn)表2、表3和表 4。結(jié)果表明，此方法的穩(wěn)定性高，β–actin、IL–1β和 IL–8變異系數(shù)分別為 0.14%～0.86%、0.18%～0.93%和0.13%～0.86%。

表2 SYBR Green RT–qPCR 方法檢測(cè)β–actin基因表達(dá)的重復(fù)性Table 2 Repeatability of SYBR Green RT–qPCR for detection of β–actin expression

表3 SYBR Green RT–qPCR 方法檢測(cè)IL–1β基因表達(dá)量的重復(fù)性Table 3 Repeatability of SYBR Green RT–qPCR for detection of IL–1β expression

表4 SYBR Green RT–qPCR 方法檢測(cè)IL–8基因表達(dá)量的重復(fù)性Table 4 Repeatability of SYBR Green RT–qPCR for detection of IL–8 expression

2.6 IL–1β和IL–8的相對(duì)表達(dá)結(jié)果

采用已建立的方法，分析得到3個(gè)健康建鯉頭腎、樣品中IL–1β和IL–8基因的相對(duì)表達(dá)量分別為1.09和1.71。

3 討 論

IL–1β和IL–8是2種重要的細(xì)胞因子，廣泛表達(dá)于魚(yú)類的腎臟、脾臟、肝臟、腸道、皮膚等組織和器官中，其中作為重要免疫器官的頭腎和脾臟中的表達(dá)量較多，因此，眾多學(xué)者也將它們?cè)陬^腎和脾臟中的表達(dá)水平作為衡量魚(yú)類免疫功能的重要指標(biāo)之一[5,9–12]。

相對(duì)于蛋白質(zhì)檢測(cè)水平的 ELISA及分子檢測(cè)水平的Northern雜交、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)等檢測(cè)方法，RT–qPCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、自動(dòng)化和重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、污染少等優(yōu)點(diǎn)，還能通過(guò)熔解曲線對(duì)產(chǎn)物的真?zhèn)魏图兌冗M(jìn)行分析鑒定。本試驗(yàn)選用 SYBR Green Ⅰ法，通用性好，能與所有雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)；靈敏度高，但容易產(chǎn)生非特異信號(hào)，所以對(duì)引物設(shè)計(jì)要求很高。在本試驗(yàn)中，每一對(duì)引物都擴(kuò)增得到了單一產(chǎn)物，說(shuō)明引物符合試驗(yàn)要求。在相對(duì)定量中，為了去除不同標(biāo)本在 RNA產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別，選擇了表達(dá)相對(duì)恒定的內(nèi)參基因β–actin對(duì)測(cè)試樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以校正作為模板的cDNA所存在的數(shù)據(jù)差異[13–14]。但是，由于β–actin基因的表達(dá)量也會(huì)受到外來(lái)刺激的影響，因此有學(xué)者建議采用2種或2種以上的參考基因[15–16]。為彌補(bǔ)本試驗(yàn)只選取1個(gè)參考基因β–actin的不足，結(jié)合目的基因的擴(kuò)增效率（E）來(lái)計(jì)算最后的結(jié)果，這樣能對(duì)目的基因真實(shí)的相對(duì)表達(dá)量起到較好的校正作用[17]。

本試驗(yàn)在建立熒光定量PCR方法的過(guò)程中有2個(gè)優(yōu)勢(shì)(特點(diǎn))，即進(jìn)行了反應(yīng)體系的退火溫度和引物濃度的優(yōu)化，最后選擇了具有最小Ct值和最強(qiáng)熒光吸收值的反應(yīng)條件。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)劣有2個(gè)指標(biāo)，即相關(guān)系數(shù)r2和擴(kuò)增效率E。r2表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性度，理想值應(yīng)大于 0.98，越接近 1, 說(shuō)明其線性程度越好，定量越準(zhǔn)確；擴(kuò)增效率E的理想值通常要在105%～95%，越接近 100%，說(shuō)明其擴(kuò)增效率越高[18]。在本試驗(yàn)中，β–actin、IL–1β和IL–8 的r2分別為0.999，0.999和0.997，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性程度好，誤差??；E分別為96.3%、103.2%和102.6%，在理想范圍內(nèi)，大大降低了因擴(kuò)增效率過(guò)低而造成的相對(duì)定量差異；所制作的3條標(biāo)準(zhǔn)曲線的 Ct值分別在 10.74～31.08、12.09～31.48和11.71～31.05 ℃，說(shuō)明檢測(cè)范圍廣。Pfaffl認(rèn)為，當(dāng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增目的產(chǎn)物時(shí)，如果Ct值變異系數(shù)小于 2.5%，則定量反應(yīng)結(jié)果可靠[17]。在本試驗(yàn)中，β–actin、IL–1β和IL–8熒光定量PCR 擴(kuò)增Ct值變異系數(shù)均小于1.0%，表明所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)這3個(gè)基因的表達(dá)重復(fù)性好，定量的結(jié)果可靠。因?yàn)閙RNA轉(zhuǎn)錄的高動(dòng)態(tài)性和樣品操作及下游處理步驟的多變性[19]，本試驗(yàn)的所有操作和注意事項(xiàng)均按照實(shí)時(shí)熒光定量 PCR國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)—MIQE指南進(jìn)行[20]，保證了建立檢測(cè)建鯉IL–1β 和IL–8基因表達(dá)方法的真實(shí)性和可靠性。

本試驗(yàn)建立的檢測(cè)建鯉 IL–1β和 IL–8基因RT–qPCR的方法具有檢測(cè)范圍廣、擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性高的特點(diǎn)，可用于檢測(cè)建鯉IL–1β、IL–8基因的相對(duì)表達(dá)量。

[1] 陳旭衍，侯亞義．魚(yú)類細(xì)胞因子研究進(jìn)展[J]．水生生物學(xué)報(bào)，2004，28(6)：668–673．

[2] Secombes C J，Hardie L J，Daniels G．Cytokines in fish：An update[J]．Fish Shellfish Immunol，1996，6(4)：291–304．

[3] Mulder I E，Wadsworth S，Secombes C J．Cytokine expression in the intestine of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) during infection with Aeromonas salmonicida [J]．Fish Shellfish Immunol，2007，23(4)：749–759．

[4] Gonzalez S F，Buchmann K，Nielsen M E．Real-time gene expression analysis in carp (Cyprinus carpio L.) skin：Inflammatory responses caused by the ectoparasite Ichthyophthirius multifiliis[J]．Fish Shellfish Immunol，2007，22(6)：641–650．

[5] Kim D H，Austin B．Cytokine expression in leucocytes and gut cells of rainbow trout，Oncorhynchus mykiss Walbaum，induced by probiotics[J]．Fish Shellfish Immunol，2006，114(3/4)：297–304．

[6] Castillo J，Teles M，Mackenzie S，et al．Stress-related hormones modulate cytokine expression in the head kidney of gilthead seabream (Sparus aurata)[J]．Fish Shellfish Immunol，2009，27(3)：493–499．

[7] Sigel M M，Hamby B A，Huggins E M．Phylogenetic studies on lymphokines：Fish lymphocytes respond to human IL–1 and epithelial cells produce an IL–1 like factor[J]．Vet Immunol Immunopathol，1986，12(1/4)：47–58．

[8] Kemenade B M L，Weyts F A A，Debets R，et al．Carp macrophage and neutrophilic granulocytes secrete an interleukin-1-like factor[J]．Dev Comp Immunol，1995，19(1)：59–70．

[9] Tanekhy M，Matsuda S，Itano T，et al．Expression of cytokine genes in head kidney and spleen cells of Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) infected with Nocardia seriolae[J]．Vet Immunol Immunopathol，2010，134(3/4)：178–183．

[10] Covello J M，Bird S，Morrison R N，et al．Cloning and expression analysis of three striped trumpeter (Latris lineata) pro-inflammatory cytokines，TNF–alpha，IL–1β and IL–8，in response to infection by the ectoparasitic，Chondracanthus goldsmidi[J]．Fish Shellfish Immunol，2009，26(5)：773–786．

[11] Fast M，Johnson S C，Jones S R M．Differential expression of the pro-inflammatory cytokines IL–1β–1，TNFα–1 and IL–8 in vaccinated pink (Oncorhynchus gorbuscha) and chum (Oncorhynchus keta) salmon juveniles[J]．Fish Shellfish Immunol，2007，22(4)：403–407．

[12] Sigh J，Lindenstr?m T，Buchmann K．Expression of proinflammatory cytokines in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) during an infection with Ichthyophthirius multifiliis [J]．Fish Shellfish Immunol，2004，17(1)：75–86．

[13] Gutierrez L，Mauriat M，Guénin S，et al．The lack of a systematic validation of reference genes：A serious pitfall undervalued in reverse transcription-polymerase chain reaction (RT–PCR) analysis in plants[J]．Plant Biotechnol J，2008，6(6)：609–618．

[14] Huggett J，Dheda K，Bustin S．Real-Time RT–PCR normalization，strategies and considerations[J]．Genes Immun，2005，6(4)：279–284．

[15] Schmid H，Cohen C，Henger A，et al．Validation of endogenous controls for gene expression analysis in micro dissected human renal biopsies[J]．Kidney Int，2003，64(1)：356–360．

[16] Vandesompele J，Preter K D，Pattyn F，et al．Accurate normalization of real-time quantitative RT–PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]．Genome Biol，2002，3 (7)：research 0034.1–0034.11．

[17] Pfaffl M．A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR[J]．Nucleic Acids Res，2001，29(9)：2002–2007．

[18] Wong M L，Medrano J F．Real-time PCR for mRNA quantitation[J]．BioTechniques，2005，39：75–85．

[19] Garson J，Huggett J，Bustin S，et al．Unreliable real-time PCR analysis of human endogenous retrovirus-W (HERV–W) RNA expression and DNA copy number in multiple sclerosis[J]．AIDS Res Hum Retroviruses，2009，25(3)：377–378．

[20] Bustin S，Benes V，Garson J，et al．The MIQE guidelines：Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments[J]．Clin Chem，2009，55(6)：611–622．

責(zé)任編輯：蘇愛(ài)華

英文編輯：羅 維

Establishment of a real-time fluorescent quantitative RT–PCR for detection of IL–1β and IL–8 genes of Cyprinus carpio var. Jian

ZENG Dong1, XIAO La1,2, NI Xue-qin1*
(1.Animal Microecology Institute, College of Veterinary, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China; 2.Animal Disease Prevention and Control Center of Leshan City, Leshan, Sichuan 614000, China)

To establish a real-time fluorescent quantitative PCR assay for detection of IL–1β and IL–8 genes of Cyprinus carpio var. Jian, specific primers were designed according to the gene sequences available in GenBank, and the β–actin gene was used as a reference gene. The standard curve and the melting curve were analyzed through SYBR Green I method. Melting curve showed specific PCR products of β–actin, IL–1β and IL–8 gene were obtained with Tm86, 82.5 and 84 ℃ , respectively.Standard curve there were good linear relationship for β–actin, IL–1β and IL–8 (r2＞ 0. 990) under detecting Ctrange of 12 to 32. The amplification efficiency were 96.3%, 103.2%, and 102.6%, respectively, and the coefficients of variation (CV) of using this developed assay to detect these genes are 0.14%-0.86%, 0.18%-0.93% and 0.13%-0.86%, respectively. Relative expression value of IL–1β and IL–8 in healthy Cyprinus carpio var. Jian was 1.07 and 1.71, respectively. Conclusion: The developed real-time fluorescent quantitative PCR assay for IL–1β and IL–8 of Cyprinus carpio var. Jian, which showed broad range, high efficiency, specificity and reliability, could be used to detect IL–1β and IL–8 expression at mRNA level.

Cyprinus carpio var. Jian; IL–1β; IL–8; real-time fluorescent quantitative PCR (RT–qPCR)

10.13331/j.cnki.jhau.2014.06.013

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

S941

A

1007?1032(2014)06?0627?06

2013–08–30

四川省科學(xué)技術(shù)廳國(guó)際合作項(xiàng)目(2013HH0055)；四川省學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)基金

曾東(1961—)，男，四川丹棱人，博士，教授，從事水產(chǎn)動(dòng)物微生態(tài)研究，zend@sicau.edu.cn；*通信作者，xueqinni@foxmail.com