陳 秀，饒雪琴，阮小蕾，李華平

(1 博羅縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 惠州 516100； 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510642)

香蕉線條病毒MP功能域基因的克隆、原核表達及抗血清制備

陳 秀1,2，饒雪琴2，阮小蕾2，李華平2

(1 博羅縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 惠州 516100； 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510642)

【目的】制備香蕉線條病毒廣東分離物(BSV-GD)MP功能域基因編碼蛋白的多克隆抗血清，為BSV基因編碼蛋白功能的研究提供條件.【方法】對BSV-GD ORF3基因氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析，得出MP功能域基因序列，克隆該基因并插入載體pET- 28b(+)構(gòu)建原核表達載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，采用超聲波裂解法進行蛋白可溶性分析，利用組氨酸標簽純化試劑盒對目的融合蛋白進行純化和回收，然后以純化的目的蛋白為抗原免疫健康家兔制備其多克隆抗血清；通過Western-blot分析該抗血清的特異性，間接ELISA法檢測該抗血清的效價.【結(jié)果和結(jié)論】MP功能域基因在ORF3中的序列為61～311 aa處，核酸序列長753 bp.試驗克隆了該基因并成功構(gòu)建了其原核表達載體pET28b-MP，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1 h后表達了相對分子質(zhì)量約為30 800的融合蛋白6His·MP.可溶性分析表明該融合蛋白以包涵體形式存在，純化獲得了高純度的目的融合蛋白，以其為抗原成功制備了BSV-GD MP功能域基因編碼蛋白的多克隆抗血清；分析表明該抗血清具有很強的特異性，其效價高達204 800倍以上.

香蕉線條病毒； MP功能域基因； 原核表達； 抗血清

香蕉線條病毒Bananastreakvirus(BSV)是香蕉上的一種dsDNA擬反轉(zhuǎn)錄病毒，屬于花椰菜花葉病毒科Caulimoviridae桿狀DNA病毒屬Badnavirus[1].BSV引起的香蕉線條病是香蕉生產(chǎn)上的主要病毒病之一，發(fā)病初期葉片產(chǎn)生連續(xù)或不連續(xù)的褪綠條斑，隨病情發(fā)展，條斑逐漸變褐壞死，假莖、葉柄和果穗有時也會出現(xiàn)條紋癥狀，不同基因型香蕉植株表現(xiàn)的癥狀存在差異[2].

BSV在世界各香蕉產(chǎn)區(qū)分布廣泛，造成了一定的經(jīng)濟損失，嚴重制約了香蕉種質(zhì)資源的調(diào)運[3]，進而制約了香蕉生產(chǎn)的健康發(fā)展.香蕉線條病在我國臺灣、廣東、云南、海南等地的香蕉產(chǎn)區(qū)已有發(fā)生[4]，基于該病害在其他國家香蕉產(chǎn)區(qū)已造成較嚴重的生產(chǎn)危害[5]，因此非常有必要展開這一病害的研究工作.

BSV具有桿狀DNA病毒的典型分子特征，基因組包含3個ORF，ORF1和ORF2編碼2個小蛋白，ORF3編碼1個大的多聚蛋白，根據(jù)同屬病毒基因組特征推測此多聚蛋白在蛋白水解酶的作用下分解為運動蛋白(Movement protein, MP)、外殼蛋白(Coat protein, CP)、天冬氨酸蛋白酶(Asepartic protease, AP)、反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcriptase, RT)和RNA酶H(RNase H, RH)[6-7].編碼這些蛋白的基因的確切位置、蛋白的大小目前還不清楚.

目前，對BSV的研究主要還是集中在病毒檢測[8-11]、病毒核酸與寄主基因組整合[12-14]和遺傳多樣性[15]等方面，而對BSV編碼蛋白的生物學(xué)功能、BSV的致病機制等方面還知之甚少，除BSV凱文迪斯株系BananastreakvirusCaverdish strain(BSV-CaV) ORF3和ORF1基因間隔區(qū)存在啟動子序列[16]的報道外，鮮見其他關(guān)于BSV基因功能的研究報道.

蛋白抗體在蛋白功能的研究中發(fā)揮著重要的作用.BSV抗血清的制備是相關(guān)研究工作開展的重要基礎(chǔ).前期已對BSV廣東分離物(BSV-GD)的ORF1和ORF2基因進行了原核表達并獲得了其高效價的多克隆抗血清[17-18].本研究擬對BSV-GD(GenBank登陸號為DQ451009)ORF3中的MP功能域基因進行原核表達并制備其編碼蛋白的多克隆抗血清，為進一步研究BSV ORF3編碼蛋白的功能奠定基礎(chǔ)，進而為弄清BSV的復(fù)制、侵染、致病機制等提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸埃希菌EscherichiacoliJM109、DH5α、Rosseta(DE3)菌株、原核表達載體pET- 28b(+)、pCAMBIA-BSV質(zhì)粒[19]和香蕉植物組織材料由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒研究室保存.pMD18-T載體、各種酶購自TAKARA公司;DNA回收試劑盒購自杭州維特潔生物技術(shù)有限公司;多聚組氨酸蛋白純化試劑盒購自德國MERCK公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG、His·Bind樹脂、10 K超濾管為美國Novagen公司產(chǎn)品，購自廣州英偉創(chuàng)津生物技術(shù)有限公司.

1.2 基因功能域的生物信息學(xué)分析

利用蛋白功能域分析軟件PROSITE(http:∥www.expasy.ch/prosite/)對BSV-GD ORF3的氨基酸序列進行分析；利用DNAStar軟件對BSV-GD ORF3氨基酸序列與BSV其他分離物及同屬其他成員的ORF3氨基酸序列進行比對分析，推測BSV-GD MP功能域基因的序列.

1.3 BSV-GD MP功能域基因的克隆和原核表達

根據(jù)BSV-GD MP功能域基因的序列設(shè)計引物petMP-FP：5′-GTCGACCATACACTATCTATGGTGGT-3′；petMP-RP：5′-AAGCTTTTAACCAAATCGTATACTCC-GTG-3′.上游引物引入SalⅠ酶切位點，下游引物引入Hind Ⅲ酶切位點.以pCAMBIA-BSV質(zhì)粒[19]為模板，PCR擴增目的基因，產(chǎn)物回收后連接到pMD18-T載體中，對重組質(zhì)粒進行測序鑒定.利用SalⅠ和Hind Ⅲ酶切位點將測序正確的MP片段連接到pET- 28b(+)中，獲得目的基因的原核表達載體pET28b-MP.

將原核表達載體pET28b-MP轉(zhuǎn)化到表達菌株E.coliRosseta(DE3)中.挑取陽性單克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至D600 nm≈0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，于37 ℃下誘導(dǎo)表達.分別取誘導(dǎo)時間為1、3、5、7 h的菌液1 mL，12 000 r·min-1離心 1 min，收集細菌，用100 μL滅菌蒸餾水重懸，并加入100 μL 2×SDS的凝膠上樣緩沖液，沸水中煮5 min，分別取15 μL上樣，進行SDS-PAGE，檢測目的蛋白是否表達.

1.4 His融合蛋白的純化和濃縮

離心收集誘導(dǎo)菌體，冰浴超聲波破碎后4 000 r·min-1離心10 min，吸出上清，沉淀溶解在1/8體積的滅菌蒸餾水中，分別取上清、沉淀溶解液進行SDS-PAGE.同時，將超聲波破碎的表達產(chǎn)物按MERCK公司組氨酸標簽純化試劑盒操作說明書進行蛋白純化，將純化后的蛋白洗脫液加入到4 mL的10K超濾管中，7 500 r·min-1離心10 min，收集超濾管底部的蛋白進行SDS-PAGE.

1.5 His融合蛋白抗血清的制備

抗原制備：第1次注射前取約100 μg·mL-1純化濃縮的融合蛋白1 mL，混合等體積福氏完全佐劑，乳化后作為抗原.第2次、第3次、第4次注射前取約100 μg·mL-1純化濃縮的融合蛋白0.5 mL，混合等體積福氏不完全佐劑，乳化后作為抗原.第5次注射前取約100 μg·mL-1純化濃縮的融合蛋白0.5 mL直接作為抗原，不加佐劑.

抗體分離和保存：取2 kg左右雄性健康新西蘭大白兔，作標記.注射抗原前取兔耳靜脈血作空白血清對照.參考何云蔚等[19]的方法分別進行皮下多點和肌肉混合注射，共免疫5次.每次各注射1～2 mL乳化抗原溶液.第1次免疫后每隔7 d免疫1次，最后一次免疫采用耳靜脈注射，抗原不加佐劑，免疫7 d后，耳靜脈采血，測定抗血清效價，效價達到要求(5 000倍以上)則心臟采血，效價不達要求則繼續(xù)加強注射1次，7 d后測效價，心臟采血.將所采血樣室溫放置約2 h，自然凝固后，置于4 ℃過夜待凝塊收縮，吸取上清液，3 000 r·min-1離心15 min，取上清，加入1 g·L-1的疊氮化鈉，-20 ℃條件保存.

1.6 抗血清的Western-blot分析

取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化了pET28b-MP質(zhì)粒的E.coliRosseta(DE3)菌體裂解液進行SDS-PAGE，以經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的未轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的E.coliRosseta(DE3)菌體裂解液和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化了pET28b-MP質(zhì)粒的E.coliRosseta(DE3)菌體裂解液為對照.取SDS-PAGE后的凝膠，直接用DYY-7型轉(zhuǎn)移電泳儀將其轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上,將硝酸纖維素膜放入可加熱封接的塑料袋中用封閉液封閉，按0.10～0.15 mL·cm-2的量加入經(jīng)TBST稀釋的一抗血清(制備的抗血清)，排除氣泡后密閉袋口，37 ℃搖床溫育1 h，然后利用TBST洗滌3次,將充分洗滌后的膜轉(zhuǎn)入新塑料袋中，加入經(jīng)TBST稀釋的酶標二抗(HRP標記的羊抗兔IgG)，37 ℃搖床溫育0.5～1.0 h，TBST洗滌3次，再用TBS洗滌2次.將膜轉(zhuǎn)移到小平皿中，加入新配制的底物液室溫作用3 min，立即用X射線膠片壓片，曝光適當時間后，定影、顯影、沖洗照片.

1.7 抗血清的效價測定

參考鄧從良等[20]的方法，用間接ELISA法進行檢測，抗原濃度為免疫注射時的1/20，抗血清用0.01%BSA的PBST緩沖液稀釋，稀釋度為1∶4～1∶204 800，設(shè)置機械零孔和空白對照，以免疫前的血清稀釋相同倍數(shù)作為陰性對照.

2 結(jié)果與分析

2.1 BSV-GD ORF3基因功能域的生物信息學(xué)分析

利用蛋白結(jié)構(gòu)域分析軟件PROSITE結(jié)合序列比對對BSV-GD 的ORF3核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析，推測出MP功能域在ORF3推導(dǎo)的氨基酸序列中位于61～311 aa處，長為251 aa，核酸序列長為753 bp.MP保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對結(jié)果如圖1所示.

圖1 BSV-GD與其他Badnavirus ORF3基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列中的MP保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對Fig.1 Alignment of BSV-GD and other Badnavirus movement protein domain concensus sequences in ORF3

2.2 BSV-GD MP功能域基因的原核表達

將PCR擴增到的BSV-GD MP功能域基因克隆到pMD18-T載體中，重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明目的基因序列與原序列完全一致.SalⅠ和Hind Ⅲ雙酶切質(zhì)粒，將目的基因連接到原核表達載體pET- 28b(+)中，構(gòu)建目的基因的原核表達載體pET28b-MP，并轉(zhuǎn)化表達菌株E.coliRosseta(DE3)，于37 ℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達.BSV-GD MP功能域基因的編碼部分含有251個氨基酸，載體上的His標簽部分為17個氨基酸，預(yù)期可表達相對分子質(zhì)量大小為30 800的蛋白產(chǎn)物.收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)若干小時的含有重組質(zhì)粒的菌體，以經(jīng)誘導(dǎo)5 h的未轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的E.coliRosseta (DE3)菌體及未經(jīng)誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的E.coliRosseta (DE3)菌體為陰性對照，以菌體裂解產(chǎn)物為上樣樣品進行SDS-PAGE，結(jié)果表明含pET28b-MP重組質(zhì)粒的菌株經(jīng)1～ 7 h誘導(dǎo)后均可特異性地表達出與預(yù)期相當大小的目的蛋白，目的蛋白的表達量在5 h內(nèi)趨于恒定，5 h后表達產(chǎn)量迅速降低(圖2).

M：低相對分子質(zhì)量蛋白Marker；1～4：含重組質(zhì)粒pET28b-MP的E.coliRosseta (DE3)分別誘導(dǎo)7、5、3、1 h的裂解產(chǎn)物； 箭頭示表達的目的蛋白；5：未經(jīng)誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的E.coliRosseta (DE3) 裂解產(chǎn)物；6:經(jīng)誘導(dǎo)的未轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的E.coliRosseta (DE3)裂解產(chǎn)物

圖2 含pET28b-MP的E.coliRosseta(DE3)表達產(chǎn)物

Fig.2 Analysis of prokaryotic expression products of His-MP gene by SDS-PAGE

2.3 融合蛋白6His·MP的純化

將表達菌菌液經(jīng)超聲波處理，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE，結(jié)果表明融合蛋白主要以包涵體的形式存在于菌體沉淀物中，上清中幾乎沒有目的蛋白(圖3).利用His·Bind樹脂對6×His 融合蛋白進行分離、純化.純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示單一的目的條帶(圖4)，表明獲得了較純的目的蛋白.

M：低相對分子質(zhì)量蛋白Marker；1：未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌全蛋白；2：誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌全蛋白；3：誘導(dǎo)菌液經(jīng)超聲裂解后的沉淀物；4：誘導(dǎo)菌液經(jīng)超聲裂解后的上清液.

圖3 SDS-PAGE進行融合蛋白6His·MP的可溶性分析

Fig.3 Soluble analysis of fusion protein 6His·MP by SDS-PAGE

M：低相對分子質(zhì)量蛋白Marker；1：未純化的蛋白(誘導(dǎo)菌液經(jīng)超聲裂解后的沉淀物)；2：純化的His融合蛋白.

圖4 純化融合蛋白6His·MP 的SDS-PAGE分析

Fig.4 Analysis of the purified fusion protein 6His·MP by SDS-PAGE

2.4 融合蛋白6His·MP抗血清的制備、特異性檢測及效價測定

以純化的融合蛋白6His·MP為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得了含多克隆抗體的血清. 將所制備的多克隆抗血清按1∶4 000稀釋，對誘導(dǎo)培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的E.coliRosseta(DE3)全蛋白進行Western-blot檢測，結(jié)果顯示在目的蛋白的位置有明顯雜交帶(圖5)，說明制備的抗血清能夠與目的蛋白發(fā)生抗原-抗體識別反應(yīng)，且特異性很強，為專化性抗血清.

用間接ELISA法測定抗血清效價，將抗血清按稀釋至1∶204 800時，仍具有明顯的陽性反應(yīng)(表1)，說明融合蛋白6His·MP在大白兔體內(nèi)具有良好的免疫性，所制備的抗血清效價在204 800倍以上.

M1：低相對分子質(zhì)量蛋白Marker，M2：EasyWestern 蛋白Marker；1：IPTG誘導(dǎo)的E.coliRosseta (DE3) 全蛋白；2：未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化pET28b-MP的E.coliRosseta (DE3) 全蛋白；3：IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化pET28b-MP的E.coliRosseta (DE3) 全蛋白.

A：SDS-PAGE對照,B:Western-blot分析.

圖5 6His·MP融合蛋白抗血清的Western-blot分析

Fig.5 Analysis of anti-fusion protein 6His·MP by Western-blot

表1間接ELISA法測定融合蛋白6His·MP抗血清的效價

Tab.1Determinationoftiterofanti-fusionprotein6His·MPbyindirectELISA

抗血清稀釋倍數(shù)D492nm抗血清對照1)比值2)1001.2900.3124.1352001.2460.3074.0594001.2330.3034.0698001.2230.3024.50016001.1020.1816.08832001.0200.1158.87064001.0100.09310.860128000.9970.08511.729256000.9320.07612.263512000.9150.06614.8641024000.8990.05915.3432048000.6130.05112.026

1) 對照為未免疫血清；2) 抗血清和對照的D492 nm的比值.

3 討論與結(jié)論

利用體外表達蛋白為抗原制備病毒的抗血清這一技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，但是抗原的制備方法要根據(jù)具體情況確定.目前用體外表達產(chǎn)物制備抗原通常有2種方法：一是利用Ni2+樹脂親和層析法純化帶標簽的融合蛋白，該法的優(yōu)點是得到的目的蛋白純度高，利于制備特異性強的抗血清，該法的缺點是Ni2+樹脂價格相對昂貴，另外純化蛋白比較耗時；二是直接從聚丙烯酰胺凝膠上切下表達產(chǎn)物制備抗血清，該法的優(yōu)點是簡便、經(jīng)濟，缺點是回收得到的表達產(chǎn)物中可能含有宿主菌的蛋白成分而降低抗血清的特異性，另外膠塊如果研磨不夠細，則會損害兔子的健康.本研究采用的是第1種方法，目的是為了得到目的蛋白的特異性抗血清，同時獲得純度高的目的蛋白，可進一步用于后續(xù)蛋白功能的研究.如果只是為了快速獲得蛋白抗血清，則建議采用第2種方法.

抗血清的制備是相關(guān)蛋白生物學(xué)功能研究工作開展的重要基礎(chǔ).前期已對BSV-GD的ORF1和ORF2基因進行了原核表達并制備了其編碼蛋白的高效價多克隆抗血清，為ORF1和ORF2編碼蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)[17-18]，而ORF3編碼蛋白在BSV的侵染和復(fù)制中起著更復(fù)雜、更重要的作用，所以研究BSV ORF3基因編碼蛋白的功能顯得尤為重要.本研究制備了BSV ORF3中MP功能域基因編碼蛋白的高效價抗血清，為進一步研究BSV ORF3編碼蛋白的功能奠定了基礎(chǔ).MP功能域基因編碼蛋白的抗血清可用于BSV編碼的MP蛋白的亞細胞定位、MP蛋白在寄主細胞和組織的定位、病毒運動方式、運動機理和寄主抗病性等多方面的研究.本研究已著手利用制備的MP功能域蛋白抗血清開展感病香蕉組織蛋白提取物的檢測、BSV-GD編碼的MP蛋白的亞細胞定位及其在寄主細胞和組織的定位等方面的研究，這對BSV運動機理的了解將會是一個突破性進展.

BSV-GD基因組測序結(jié)果表明基因組全長6 950 bp，共含有3個開放閱讀框，ORF3全長為5 130 bp，編碼1 709個 aa[21].本研究對ORF3氨基酸序列的生物信息學(xué)分析表明其氨基酸序列含有5個功能位點，依次是植物病毒運動蛋白保守序列、運動鋅指環(huán)結(jié)構(gòu)(典型的病毒外殼蛋白結(jié)構(gòu))、天冬氨酸蛋白酶位點、反轉(zhuǎn)錄酶功能域位點、RNA酶H功能域位點，得出了BSV-GD 編碼MP的基因的較確切的位置，克隆了含MP功能域的基因，構(gòu)建了該基因的原核表達載體，將該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌并誘導(dǎo)表達了N-端帶His標簽的目的蛋白，回收得到了高純度的目的蛋白，以純化的目的蛋白為抗原免疫健康家兔制備了高效價、?；缘亩嗫寺】寡澹瑸锽SV ORF3編碼蛋白的功能研究和BSV運動機理的研究奠定了基礎(chǔ).

[1] GAYRAL P, ISKRA-CARUANA M L. Phylogeny ofBananastreakvirusreveals recent and repetitive endogenization in the genome of its banana host (Musasp.)[J]. J Mol Evol,2009, 69(1): 65- 80.

[2] WAMBULWA M C, WACHIRA F N, KARANJA L S, et al. The influence of host and pathogen genotypes on symptom severity in banana streak disease[J]. Afr J Biotech-nol, 2013, 2(1): 27-31.

[3] LHEUREUX F, LABOUREAU N, MULLER E, et al. Molecular characterization of banana streak acuminata Vietnam virus isolated fromMusaacuminatasiamea(banana cultivar)[J]. Arch Virol, 2007, 152(7): 1409-1416.

[4] ZHUANG Jun, WANG Jianhua, ZHANG Xin, et al. Molecular characterization ofBananastreakvirusisolate fromMusaacuminatain China[J]. Viro Sin, 2011, 26(6): 393- 402.

[5] DANIELLS J W, GEERING A D W, BRYDE N J, et al. The effect ofBananastreakviruson the growth and yield of dessert bananas in tropical Australia[J]. Ann Appl Biol, 2001, 139(1):51- 60.

[6] HOHN T, FUTTERER J. The proteins and functions of plant pararetroviruses: Knowns and unknowns[J]. Crit Rev Plant Sci, 1997,16(1): 133-161.

[7] VERMA R, MUNGEKAR D, GAIKWAD P, et al. Molecular characterization ofBananastreakvirusisolate from banana cultivar Kanchi kela of ABB genotype[J]. J Mycol Plant Pathol, 2012, 42(1): 124-127.

[8] SHARMAN M, THOMAS J E, DIETZGEN R G. Development of a multiplex immunocapture PCR with colourimetric detection for viruses of banana[J]. J Virol Methods, 2000, 89(1/2): 75- 88.

[9] GREGOIRE L P, MARIE-LINE I C, ISABELLE A. Improved detection of episomalBananastreakvirusby multiplex immumocaptrue PCR[J]. J Virol Methods, 2006,137(1): 7-13.

[10]JAMES A P, GEIJSKES R J, DALE J L, et al. Development of a novel rolling-circle amplification technique to detectBananastreakvirusthat also discriminates between integrated and episomal virus sequences[J]. Plant Dis, 2011,95(1): 57- 62.

[11]PENG Jun, FAN Zaifeng, HUANG Junsheng. Rapid detection ofBananastreakvirusby loop-mediated isothermal amplification assay in South China[J]. J Phytopathol, 2012, 160(5): 248- 250.

[12]HARPER G, HULL R, LOCKHART B, et al. Viral sequences integrated into plant genomes[J]. Annu Rev Phytopathol, 2002,40: 119-136.

[13]GEERING A D W, POOGGIN M M, OLSZEWSKI N E, et al. Characterisation of Banana streak Mysore virus and evidence that its DAN is integrated in the B genome of cultivatedMusa[J]. Arch Virol, 2005,150(4): 787-796.

[14]GAYRAL P, NOA-CARRAZANA J, LESCOT M, et al. A singleBananastreakvirusintegration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus[J]. J Virol, 2008, 82(13): 6697- 6710.

[15]HARPER G, HART D, MOULT S, et al.Bananastreakvirusis very diverse in Uganda[J]. Virus Res, 2004,100(1): 51-56.

[16]REMANS T, GROF C P L, EBERT P R, et al. Identification of functional sequences in the pregenomic RNA promoter of theBananastreakvirusCavendish strain (BSV-CaV)[J]. Virus Res, 2005, 108(1/2): 177-186.

[17]何云蔚，陳秀，阮小蕾，等．香蕉線條病毒ORFⅠ基因的原核表達及抗體制備[J]．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，30(3)：89-91.

[18]何云蔚，陳秀，阮小蕾，等．香蕉線條病毒ORFⅡ基因的原核表達及抗體制備[J]．植物病理學(xué)報，2009，39(1)：100-103.

[19]何云蔚，阮小蕾，陳秀，等．香蕉線條病毒侵染性克隆的構(gòu)建[C]∥彭友良，朱有勇.中國植物病理學(xué)會2009年學(xué)術(shù)年會論文集.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2009：351-352.

[20]鄧叢良，韓麗娟，燕照玲，等．白草花葉病毒CP基因在大腸桿菌中的表達及抗血清的制備[J]．植物病理學(xué)報，2005，35(5)：442- 445.

[21]謝麗君，何云蔚，陳秀，等．香蕉線條病毒廣東分離物基因組序列測定和特征分析[C]∥彭友良，康振生.中國植物病理學(xué)會2007年學(xué)術(shù)年會論文集.楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社，2007：267- 269.

【責(zé)任編輯霍 歡】

ProkaryoticexpressionandantiserumpreparationforfunctionaldomainofBananastreakvirusmovementproteingene

CHEN Xiu1,2，RAO Xueqin2, RUAN Xiaolei2, LI Huaping2

(1 Boluo County Institute of Agricultural Sciences, Huizhou 516100, China; 2 College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 To provide antibody ofBananastreakvirusGuangdong isolate (BSV-GD) and to provide references for the function research of proteins encoded by BSV ORF3 further. 【Method】 The MP functional gene sequence was obtained through bioinformatics analysis. The gene was cloned and inserted into the plasmid pET- 28b(+) to construct the prokaryotic expression recombinant plasmid. The recombinant vector was induced by IPTG to express the fusion protein 6His·MP. Soluble analysis of the fusion protein was carried out by ultrasonic lysis method. The highly purified protein was obtained by His-tag purification kit. The special polyclonal antibody was generated by immunizing healthy rabbit using the purified protein as antigen. The specificity of antiserum was detected by Western-blot. The antibody titer was determined by indirect enzyme immunoassay. 【Result and conclusion】The analysis showed that the MP functional gene was 61-311 aa of the ORF3 sequence and the nucleotide sequence length was 753 bp. The prokaryotic expression recombinant plasmid pET28b-MP was constructed, and the expressed fusion protein 6His·MP was about 30 800 in size. Soluble analysis of the fusion protein indicated that it was an inclusion body. The highly purified target protein was obtained. The special polyclonal antiserum was generated according to the purified protein. The assay suggested that the antiserum had very strong specificity, and the antibody titer was higher than 1∶204 800.

Bananastreakvirus; movement protein domain; prokaryotic expression; antiserum

2013- 04- 16優(yōu)先出版時間2014- 01- 03

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140103.0828.011.html

陳 秀(1983—)，女，博士，農(nóng)藝師，E-mail：63753448@qq.com；通信作者：李華平(1961—)，男，教授，博士，E-mail: huaping@scau.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(30671358)；廣東省自然科學(xué)基金(C036845)

陳 秀，饒雪琴，阮小蕾，等.香蕉線條病毒MP功能域基因的克隆、原核表達及抗血清制備[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014,35(2):47- 52.

S432.4+1

A

1001- 411X(2014)02- 0047- 06