師如意，張秀娟，白銀山，衛(wèi)恒習(xí)，李 莉，張守全

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點實驗室，廣東 廣州 510642；2 山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/省部共建教育部細胞生理學(xué)重點實驗室，山西 太原 030001；3 廣東省昆蟲研究所，廣東 廣州 510260)

豬精原干細胞超微結(jié)構(gòu)觀察與體外凍存條件的優(yōu)化研究

師如意1,2，張秀娟1,3，白銀山1，衛(wèi)恒習(xí)1，李 莉1，張守全1

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點實驗室，廣東 廣州 510642；2 山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/省部共建教育部細胞生理學(xué)重點實驗室，山西 太原 030001；3 廣東省昆蟲研究所，廣東 廣州 510260)

【目的】檢測豬精原干細胞(PSSCs)在分化過程中其內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)及細胞器的變化情況，并且找到適宜PSSCs的冷凍保存條件，為長期保存PSSCs和研究PSSCs的分化機制提供科學(xué)依據(jù).【方法】采用兩步酶消化法和Percoll不連續(xù)密度梯度法獲取PSSCs，利用透射電子顯微鏡(TEM)對PSSCs在體外不同培養(yǎng)時間的超微結(jié)構(gòu)變化進行觀測，并且利用臺盼藍染色法和堿性磷酸酶(AP)染色法比較不同濃度的甘油和二甲基亞砜(DMSO)保存液對PSSCs凍存效果的影響.【結(jié)果和結(jié)論】未分化的PSSCs細胞膜完整平滑，細胞器正常，胞質(zhì)均勻，無偽足出現(xiàn)，細胞核清晰.而開始分化的PSSCs出現(xiàn)偽足，線粒體數(shù)量大幅增加.凍存7 d后，解凍結(jié)果表明，PSSCs以V(DMSO)∶V(DMEM/F12)∶V(FBS)∶V(100× 雙抗) =10∶69∶20∶1為宜.

豬精原干細胞； 超微結(jié)構(gòu)； 凍存

干細胞生物學(xué)特性的研究是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點問題，精原干細胞(Spermatogonial stem cells, SSCs)作為其中一部分，近年來成為干細胞生物學(xué)的重點研究模型，因為SSCs的自我更新和分化牽涉到生命科學(xué)領(lǐng)域的許多方面，并且SSCs是雄性哺乳動物體內(nèi)唯一能夠?qū)⒒蛐畔鬟f給下一代的干細胞，更為重要的是它強大的功能分析優(yōu)勢[1].因此，研究SSCs在分化發(fā)育過程中其細胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化有著很重要的意義.

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一.利用凍存技術(shù)將細胞置于-80～-196 ℃的環(huán)境條件中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，在需要的時候再復(fù)蘇細胞用于試驗.同時，適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用.除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞.所以提供長期保存的SSCs是進行基礎(chǔ)研究的必需途徑，如果無法進行長期冷凍保存，那么SSCs的利用率將大大降低，無法突破地域的限制.

因為物種間的差異，SSCs冷凍條件也因物種而異.有研究人員報道牛SSCs冷凍后保持生物活性的能力，同時進行了再移植，發(fā)現(xiàn)在移植后的2～3個月能形成克隆[2-3].對于小鼠而言，凍存一段時間之后，睪丸混合細胞仍可用于SSCs移植，并且將冷凍后小鼠SSCs移植入不育小鼠睪丸，結(jié)果不育小鼠產(chǎn)生了后代[4-5].對于人類而言，當(dāng)孩子被確診為癌癥時，作為男孩子的家長越來越多的要求對其孩子的SSCs進行長期的冷凍保存，以防孩子在進行抗癌治療過程中喪失生育能力[6].

作為與人類親緣關(guān)系較近的豬，其生理生化指標(biāo)及解剖結(jié)構(gòu)很多與人類相似，越來越多地被用作藥物及某些人類疾病的研究，是一種理想的模式動物.如何對豬SSCs(PSSCs)進行冷凍保存仍需進一步的研究.基于此，本試驗利用透射電子顯微鏡對體外培養(yǎng)不同時間的PSSCs超微結(jié)構(gòu)進行觀測，并研究甘油、二甲基亞砜(DMSO)作為凍存保護劑對PSSCs的影響，為進一步研究PSSCs的冷凍保存技術(shù)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究對象與主要試劑

5日齡之內(nèi)的長白仔公豬，購于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)原種豬場；明膠、Ⅳ型膠原酶粉末、0.25%胰酶-EDTA溶液等為Sigma公司產(chǎn)品；100×雙抗溶液、DMEM/F12液體培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone 公司產(chǎn)品；NBT/BCIP染液為北京鼎國生物有限公司產(chǎn)品；Percoll 為Pharmacia公司產(chǎn)品；DMSO、甘油、戊二醛、鋨酸、醋酸鈾、枸櫞酸鉛、Epson 812樹脂為Sigma公司產(chǎn)品.

1.2 PSSCs的分離純化

PSSCs的分離純化：利用兩步酶消化法獲取睪丸混合細胞懸液，利用Percoll不連續(xù)密度梯度法純化PSSCs，具體操作步驟及所需用品參考本課題組已發(fā)表文獻[7].

1.3 PSSCs不同培養(yǎng)時間的超微結(jié)構(gòu)觀測

1.3.1 PSSCs的基礎(chǔ)培養(yǎng)條件 37 ℃條件下，V(CO2)∶V(空氣)=5∶95，100%飽和濕度.

SSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制：V(DMEM/F12不完全培養(yǎng)基)∶V(FBS)∶V(100×雙抗溶液)∶V(必需氨基酸溶液)∶V(非必需氨基酸溶液)=87∶10∶1∶1∶1其中含有2 mmol/LL-谷氨酰胺和丙酮酸鈉.無細胞因子添加.

1.3.2 PSSCs的收集 將體外培養(yǎng)不同時間的PSSCs以16 ℃條件下, 1 500 r/min(453 g)離心5 min，之后用PBS清洗1～2次，相同參數(shù)進行離心.去掉上清液，用體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛固定細胞沉淀.1.3.3 PSSCs透射電鏡超薄切片的制作 1)將體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛固定后的細胞用12 g/L的瓊脂糖包埋，包埋后可置于體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛固定液中保存1周；2)用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗樣去固定液，洗6次，每次20 min；3)4 ℃條件下用10 g/L鋨酸固定2 h；4)用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗樣去鋨酸，洗6次，每次10 min；5)梯度乙醇逐級脫水；6)梯度丙酮逐級脫水；7)Epson 812樹脂包埋，超薄切片；8)醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色；透射電子顯微鏡觀察.

1.4 PSSCs細胞凍存液的配置

PSSCs不同細胞凍存液具體成分如下(均含1%雙抗)：

組1，V(DMSO)∶V(DMEM/F12)∶V(FBS)∶

V(100×雙抗)=5∶74∶20∶1;

組2，V(DMSO)∶V(DMEM/F12)∶V(FBS)∶V(100×雙抗)=10∶69∶20∶1;

組3，V(DMSO)∶V(DMEM/F12)∶V(FBS)∶

V(100×雙抗)=20∶59∶20∶1;

組4，V(甘油)∶V(DMEM/F12)∶V(FBS)∶V(100×雙抗)=5∶74∶20∶1;

組5，V(甘油)∶V(DMEM/F12)∶V(FBS)∶V(100×雙抗)=10∶69∶20∶1.

將純化好的PSSCs，按照5×105mL-1的密度，用不同的凍存液凍存.先放入4 ℃冰箱預(yù)冷20 min，再放入-20 ℃的冰箱預(yù)冷20 min，最后放入-80 ℃的超低溫冰箱進行凍存研究.分別在1、3、7 d定時解凍，用臺盼藍染色，檢測細胞活率，細胞活率較低的組則直接淘汰，活率高的組則進行堿性磷酸酶(AP)染色以鑒定PSSCs是否分化并進行體外培養(yǎng)試驗以觀測其復(fù)蘇后基本生物學(xué)特性的變化情況.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用EXCEL和SPSS 14.0統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 PSSCs在體外不同培養(yǎng)時間的超微結(jié)構(gòu)觀察

隨著PSSCs在體外培養(yǎng)時間的不同，其外部形態(tài)會發(fā)生變化.同時，PSSCs內(nèi)部各類細胞器數(shù)目及結(jié)構(gòu)也會伴隨著變化.圖1A中可見，PSSCs在體外培養(yǎng)24 h時，細胞外部光滑，細胞呈鏈狀存在；圖1B中可見，體外培養(yǎng)8 d后，PSSCs表面出現(xiàn)偽足，細胞膜表面粗糙不平，表明PSSCs體外開始分化.經(jīng)過透射電鏡檢測，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)2 d的PSSCs胞質(zhì)均勻，胞膜光滑平整，細胞核明顯，細胞器正常(圖2A、2B)；體外培養(yǎng)8 d的PSSCs表面有偽足突起產(chǎn)生，細胞內(nèi)部線粒體數(shù)目大量增多(圖2C、2D).

A： 24 h的情況; B： 8 d偽足出現(xiàn)(箭頭)；標(biāo)尺=20 μm.

Fig.1 The shape changes of PSSCs during different culturing periodsinvitro

A：PSSCs體外培養(yǎng)24 h情況，黑色箭頭表示線粒體，白色箭頭表示細胞核核仁；B：A圖局部放大后情況;C：PSSCs體外培養(yǎng)8 d情況，箭頭表示線粒體，圓圈內(nèi)是突起的偽足；D：C圖局部放大后情況;A、C圖標(biāo)尺=2 μm ，B圖標(biāo)尺=200 nm，D圖標(biāo)尺=500 nm.

圖2 體外培養(yǎng)不同時間PSSCs透射電鏡掃描圖

Fig.2 The ultrastructure of PSSCs during different culturing periodsinvitro

2.2 不同體積分?jǐn)?shù)DMSO的凍存效果

由表1可知，在凍存1 d后，體積分?jǐn)?shù)為10%和5%DMSO的凍存液中細胞的成活率均高于80%，而體積分?jǐn)?shù)為20%DMSO的凍存液中的細胞成活率只有40%，差異顯著(P<0.05).到第7天的時候，只有體積分?jǐn)?shù)為10%DMSO的凍存液中的細胞成活率高過80%，其余體積分?jǐn)?shù)的DMSO凍存的細胞成活率大幅下降.同時，隨著凍存時間的延長，不同體積分?jǐn)?shù)DMSO凍存的細胞成活率均大幅下降，體積分?jǐn)?shù)為5%DMSO凍存的細胞成活率由85%降到了不足60%，而體積分?jǐn)?shù)為20%DMSO凍存的細胞成活率從40%降到了14%，只有體積分?jǐn)?shù)為10%DMSO凍存的細胞成活率維持在80%左右基本不變，所以用體積分?jǐn)?shù)為10%DMSO的細胞凍存液進行細胞冷凍-復(fù)蘇后體外培養(yǎng)試驗.

表1不同體積分?jǐn)?shù)的DMSO的凍存效果1)

Tab.1TheeffectofdifferentvolumefractionsofDMSOoncryopreserving

φ(DMSO)/%成活率/%1d3d7d585.92±0.25a83.15±9.36a59.98±0.7b1086.39±2.03a79.75±2.25a80.96±1.77a2040.16±3.35b22.98±5.15b14.22±2.66c

1)表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=5,同列數(shù)據(jù)后凡有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著(P>0.05,t檢驗).

2.3 不同體積分?jǐn)?shù)甘油的凍存效果

由表2可知，在凍存1 d后，體積分?jǐn)?shù)為10%和5%的甘油的細胞成活率差異顯著(P<0.05)，但成活率都沒有超過40%.到了第3天時，二者的差異仍然顯著，但是凍存的細胞成活率均大幅下降，都沒超過30%.由于甘油凍存液凍存的SSCs解凍后成活率非常低，所以，之后的AP染色及體外培養(yǎng)試驗終止.

表2不同體積分?jǐn)?shù)的甘油的凍存效果1)

Tab.2Theeffectofdifferentvolumefractionsofglyceroloncryopreserving

φ(甘油)/%成活率/%1d3d514.14±2.12b7.46±3.87c1033.63±6.36a29.85±3.49a

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=5，同列數(shù)據(jù)后凡有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著(P>0.05,t檢驗).

2.4 PSSCs復(fù)蘇后體外培養(yǎng)試驗

據(jù)表1、表2結(jié)果，PSSCs的冷凍-復(fù)蘇后體外培養(yǎng)試驗用體積分?jǐn)?shù)為10%DMSO的細胞凍存液進行.將凍存7 d的PSSCs復(fù)蘇后用AP染色，著色率為(82.94±2.44)%(圖3A)，同時進行體外培養(yǎng)，36 h后，有細胞團形成(圖3B)，表明解凍后的PSSCs大部分仍表現(xiàn)干細胞的性質(zhì),并且其基本生物學(xué)特性未受到影響.

A： PSSCs解凍后AP染色，白色箭頭所指為未分化PSSC，黑色剪頭所指為已分化PSSC，標(biāo)尺=20 μm； B ：PSSCs解凍后體外培養(yǎng)36 h，標(biāo)尺=50 μm.

圖3 PSSCs解凍后體外培養(yǎng)36 h情況
Fig.3 The PSSCs culturedinvitrofor 36 h after thawing

3 討論

3.1 長白仔豬SSCs不同培養(yǎng)時間細胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的觀察

SSCs在體內(nèi)最終會分化成精子，已有報道稱SSCs在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化可以形成圓形精子細胞，伴隨有鞭毛出現(xiàn)，并且發(fā)現(xiàn)帶鞭毛的精子細胞可以產(chǎn)生有繁殖力的小鼠后代[8-9].

本課題組前期已利用原子力顯微鏡(AFM)對未分化的PSSCs表面超微結(jié)構(gòu)及細胞力學(xué)特性進行了檢測[10].但PSSCs在分化過程中，其細胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化及細胞器的變化情況并未進行觀測，本次試驗經(jīng)過透射電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)未分化的PSSCs細胞膜完整平滑，細胞器正常，胞質(zhì)均勻，無偽足出現(xiàn)，細胞核清晰.而出現(xiàn)偽足的PSSCs，其內(nèi)部線粒體的數(shù)量都大幅增加，線粒體是用來給細胞提供能量的，與細胞的生命活動旺盛程度有關(guān).當(dāng)細胞偽足出現(xiàn)時，細胞潛在的“運動量”會增加，此時已開始分化，出現(xiàn)偽足后要為將來變成精子游動而做準(zhǔn)備，細胞所需的能量大幅增加，所以其線粒體數(shù)量在出現(xiàn)偽足時相應(yīng)地大幅增加.對PSSCs在分化過程中內(nèi)部結(jié)構(gòu)及細胞器數(shù)目變化的觀測將為研究SSCs本身的生物學(xué)特性提供科學(xué)依據(jù).

3.2 長白仔豬PSSCs的凍存研究

細胞冷凍打破了細胞的正常生理過程，在細胞內(nèi)部形成冰晶，破壞細胞的正常結(jié)構(gòu)，對細胞造成一定的損傷，在冷凍過程中添加一定劑量的冷凍保護劑可以在一定程度上降低冷凍所造成的損傷.現(xiàn)在一般認(rèn)為加入冷凍保護劑主要有以下作用：1)可以沖淡溶液中溶質(zhì)濃度，使細胞攝入的鹽量降低；2)進入細胞，改變細胞內(nèi)過冷狀態(tài)，使胞內(nèi)壓接近胞外壓，降低細胞脫水皺縮程度和速度；3)冷凍劑進出細胞容易，緩解復(fù)蘇時滲透性腫脹引起的損傷[11].

DMSO是一種相對分子質(zhì)量較小、滲透性強的化學(xué)物質(zhì)，是目前最常采用的細胞凍存保護劑,其作用機制是可降低培養(yǎng)液冰點并防止游離蛋白質(zhì)聚集,提高細胞膜對水的通透性[12]；凍存前滲透到細胞內(nèi)的DMSO可以降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)濃度,從而保護細胞免受高濃度電解質(zhì)損傷,同時細胞內(nèi)水分不會過度外滲,避免細胞過度脫水皺縮[13].有研究表明，用DMSO對成年恒河猴SSCs進行冷凍保存，復(fù)蘇后進行裸鼠的異種移植，在睪丸的基底膜處會形成鏈狀細胞和克隆團[14].Ogura 等[15]研究人員對金黃倉鼠睪丸細胞凍存后，復(fù)蘇存活的細胞達到43%.有研究報道，利用冷凍人類卵巢組織的方法對小鼠及人睪丸組織進行凍存，將DMSO 作為冷凍保護劑，解凍后的睪丸組織獲得了良好的形態(tài)[16-17].

對牛SSCs進行冷凍保存后，SSCs仍具有保持生物活性的能力，對其進行再移植，發(fā)現(xiàn)在移植后的2～3個月仍能形成克隆[2].在對雞SSCs進行冷凍保存試驗時，相較于甘油來說，DMSO可以作為雞SSCs最佳的冷凍保護劑[18].但是，DMSO對細胞有一定的毒性，濃度過高不利于細胞復(fù)蘇后的存活與活性的恢復(fù).

由本試驗結(jié)果可知，體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO組成的凍存液的凍存效果最好，并且解凍后在體外培養(yǎng)36 h還會形成細胞團，并且可以被AP染色.體積分?jǐn)?shù)為20%的DMSO與體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO的試驗結(jié)果差異顯著，表明體積分?jǐn)?shù)高的DMSO對于PSSCs的凍存來說也是有害的.

甘油是凍存動物精子最常用的抗冷凍劑，它能滲入細胞內(nèi)部，濃縮或者結(jié)合胞內(nèi)水分，降低溶液中鹽的濃度和冷凍液的滲透壓，從而發(fā)揮其對細胞的保護作用[19].

對于甘油作為冷凍保護劑凍存PSSCs來說，活率非常低，甚至連30%都不足，這說明甘油作為PSSCs的抗冷凍劑效果較差，反映出冷凍精原干細胞與冷凍精液有著較大的本質(zhì)不同，所以在對PSSCs進行低溫冷凍保存時，應(yīng)使用抗凍效果相對良好的DMSO而非甘油，此結(jié)果與其他物種SSCs冷凍研究結(jié)果相似，可為以后對PSSCs長期研究奠定基礎(chǔ).

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【責(zé)任編輯柴 焰】

Ultrastructureofporcinespermatogonialstemcells(PSSCs)culturedinvitroandoptimizationofcryopreservingconditions

SHI Ruyi1,2, ZHANG Xiujuan1,3, BAI Yinshan1, WEI Hengxi1, LI Li1, ZHANG Shouquan1

(1 College of Animal Science, South China Agricultural University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding, Guangzhou 510642, China;2 Preclinical Medical College, Shanxi Medical University/Key Laboratory of Cellular Physiology, Ministry of Education, Taiyuan 030001, China; 3 Guangdong Entomological Institute, Guangzhou 510260, China)

【Objective】The aim of this research was to optimize the cryopreserving conditions of porcine spermatogonial stem cells (PSSCs) and observe the changes of ultrastructure in PSSCs. 【Method】The testicular cells of Landrace piglets aged from 1 day to 5 days were isolated by two-step enzymatic digestion method. The percoll discontinuous density gradients method was used to purify PSSCs. The transmission electron microscope (TEM) was used to observe the ultrastructure of PSSCs during different culturing periodsinvitro. The effects of glycerine and dimethyl sulfoxide (DMSO) on PSSCs cryopreserving were investigated. 【Result and conclusion】The results showed that the cell membrane of undifferentiated PSSCs was integrated and smoothed without pseudopodia, the cytoplasm was homogeneous and nucleus was clear. The pseudopodia were formed in differentiated PSSCs and the number of the mitochondria greatly increased. The appropriate cryopreserving medium for PSSCs isV(DMSO)∶V(DMEM/F12)∶V(FBS)∶V(100×Penicillin/Streptomycin solution)=10∶69∶20∶1.

porcine spermatogonial stem cells (PSSCs); ultrastructure; cryopreserving

2013- 07- 03優(yōu)先出版時間2014- 01- 03

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140103.0834.034.html

師如意(1982—)，男，博士,E-mail:tomruyi@163.com；通信作者：張守全(1964—)，男，教授，博士，E-mail: sqzhang@scau.edu.cn

973計劃項目(2011CB944202,2009CB941601,2010CB945001)；國家科技支撐計劃(2011BAD19B03)

師如意，張秀娟，白銀山，等.豬精原干細胞超微結(jié)構(gòu)觀察與體外凍存條件的優(yōu)化研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014,35(2):1- 5.

Q954.43

A

1001- 411X(2014)02- 0001- 05