張金文，杜春海，汪 冉（.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科，河北 石家莊 050000;.河北省景縣人民醫(yī)院外科,河北 景縣 05500;.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050000）

·論著·

半翼基因蛋白在實(shí)驗(yàn)鼠卵細(xì)胞聯(lián)會(huì)復(fù)合體中的表達(dá)位置

張金文1，杜春海2，汪 冉3
（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科，河北 石家莊 050000;2.河北省景縣人民醫(yī)院外科,河北 景縣 053500;3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050000）

目的探討半翼基因（wings apart-like,Wapl）蛋白在實(shí)驗(yàn)鼠粗線期的卵細(xì)胞中聯(lián)會(huì)復(fù)合體（synaptonemal complex，SC）的表達(dá)位置。方法從受孕18.5d胎鼠的卵巢中分離出處于粗線期的卵細(xì)胞，然后用抗-聯(lián)合復(fù)合體蛋白2（anti-synaptonemal complex protein 2,SYCP2）和 抗-Wapl蛋白進(jìn)行雙免疫染色。結(jié)果SYCP2和Wapl在所檢查粗線期的卵細(xì)胞位置重疊。結(jié)論Wapl可能是粗線期卵細(xì)胞SC的一部分。

合子；聯(lián)會(huì)復(fù)合體；蛋白質(zhì)類；大鼠

果蠅半翼基因（wingsapart-like,Wapl）蛋白在調(diào)解異染色質(zhì)形成和染色體分離中起重要的作用[1-2]。在人和實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)，Wapl主要在睪丸內(nèi)表達(dá)[3]。免疫細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)鼠Wapl位于粗線期的精母細(xì)胞聯(lián)會(huì)復(fù)合體（synaptonemalcomplex，SC）中[3]。SC是一個(gè)減數(shù)分裂的特異結(jié)構(gòu)，它由橫絲（transversefilaments，TFs）相連的一對(duì)側(cè)板（lateralelements，LEs）組成，它在第1次減數(shù)分裂的粗線期成熟。在第1次減數(shù)分裂的前期，SC精密的調(diào)整著一系列的反應(yīng)，包括染色體配對(duì)、SC裝配、同源染色體之間遺傳物質(zhì)互相交換（交叉重組）。這些事件確保了在第1次減數(shù)分裂同源染色體保持聯(lián)接在一起并在保證它們準(zhǔn)確地排列在赤道板上，以及隨后向著相反的紡垂體移動(dòng)。同源染色體識(shí)別錯(cuò)誤或同源染色體遺傳物質(zhì)交換障礙必定會(huì)破壞同源染色體的分離和移動(dòng)，導(dǎo)致產(chǎn)生非整倍體配子[4]。在許多減數(shù)分裂的基因突變的研究中，已證實(shí)SC的形成或解體與同源染色體正常分離有密切相關(guān)性[1，5-6]。已證實(shí)在缺乏聯(lián)合復(fù)合體蛋白3（synaptonemalcomplexprotein3，SYCP3）實(shí)驗(yàn)鼠的卵細(xì)胞中，由于SYCP3缺陷的誘導(dǎo)致使減數(shù)分裂染色體錯(cuò)誤隔離而產(chǎn)生非整倍體配子[7]。由于SC功能上的重要性，我們研究了雌性實(shí)驗(yàn)鼠生殖細(xì)胞中Wapl可能存在的位置，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)鼠：C57BL/6N實(shí)驗(yàn)鼠（BarHarbor,ME，證號(hào)129P2/01aHsd）喂養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)施內(nèi)，室溫控制在22℃，12h光照，12h黑暗，水和食物擺放在實(shí)驗(yàn)鼠能自由接觸的位置。2只成年雌鼠和1只雄鼠放入一個(gè)籠子內(nèi)，標(biāo)記有陰道精斑雌鼠，于18.5d從胎鼠中采集處于粗線期的卵細(xì)胞。

1.2 胎鼠卵巢粗線期卵細(xì)胞的采集：采用“dry-down”技術(shù)，在受孕后18.5d，從雌性胚胎收集卵巢[8]。解剖出胚胎的卵巢放入PBS液體中，轉(zhuǎn)移到hypo-extractionbuffer液體25～30min。每對(duì)卵巢放入25μL100mmolSucrose器皿中,用注射器針頭搗碎，10μL懸浮液滴到玻璃載物片，該玻璃載物片事先用新鮮配制的1%PFA液體浸泡。玻璃載物片立即放入濕熱箱讓其慢慢晾干2～6h，然后洗滌玻璃載物片用0.04%KodakPhotoFlo液體，空氣晾干玻璃載物片，在相差顯微鏡下，粗線期的生殖細(xì)胞呈現(xiàn)為體積大而蓬松的形狀。晾干的玻璃載物片-20℃或-80℃儲(chǔ)存直到下一次應(yīng)用。

1.3 免疫熒光染色：粗線期的卵細(xì)胞，在37℃的條件下分別與第一抗體及第二抗體孵化1h，隨后，在37℃的條件下用PBS洗刷。這些卵細(xì)胞與2種第一抗體多克隆荷蘭豬抗-SYCP2（1∶500稀釋）[9]和多克隆荷兔抗-Wapl（1∶400稀釋）[3]共同孵育，然后，按1∶1 200稀釋affinity-purifiedCy3-conjugated兔抗鼠IgG（JacksonImmuno-ResearchLaboratories,Suffolk,UK）和1∶100稀釋豬抗兔異硫氰酸熒光素（DakoCytomation,Glostrup,Denmark）。核染色質(zhì)用DAPI（400μg/L;SigmaD-9542,Sigma-AldrichInc;St.Louis,MO,USA）進(jìn)行染色2min，用PBS迅速洗滌卵細(xì)胞，以抗褪色劑（MolecularProbes;Eugene,OR,USA）封閉玻璃載物片。利用顯微鏡（LeicaDMRA2andDMRXA：LeicaMikroskopieunderSystemGmbH;Wetzlar,Germany）和螢光顯微鏡（×1 000）以及照相機(jī)（C4742-95（HamamatsuPhotonicSystems;Hamamatsucity,Japan）記記下卵細(xì)胞的形態(tài)變化并用OpenlabTMsoftwareversion3.1.4（ImageProcessing&VisionCompanyLimited;Coventry,UK）進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

Wapl和SYCP2（哺乳類動(dòng)物卵細(xì)胞中SC的一個(gè)標(biāo)志蛋白）在粗線期的卵細(xì)胞中處于重疊位置（圖1）。

圖1Wapl與SYCP2在實(shí)驗(yàn)鼠粗線期的卵細(xì)胞SC上呈重疊分布（免疫組織化學(xué) ×1 000）
Figure1ColocalizationofWaplwithSYCP2ontheSCinthemousepachyteneoocytes（immunohistochemistry×1 000）

A.伸展和固定的卵細(xì)胞染色體被抗-SYCP2染成紅色；B.抗-Wapl呈綠色;C.A+B合并
A.Chromosomalspreadofoocytesatpachynemafixedandstainedwithanti-SYCP2 （red）;B.anti-Wapl（green）;C.mergedimage

3 討 論

Wapl最早是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其所編碼的蛋白可調(diào)節(jié)異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，突變的Wapl基因在異染色質(zhì)區(qū)域阻止了姐妹染色單體的正常靠近和并列，但不影響染色體的凝集和分離。Wapl基因在有絲分裂的異染色質(zhì)區(qū)域?qū)τ诰S持姐妹染色單體的粘連起著非常重要的作用，同時(shí)也調(diào)節(jié)染色體的功能[1-2]。目前，在人類約有20%不孕癥及胚胎死亡是由卵細(xì)胞染色體非整倍體引起。0.3%新生兒患有智能障礙，如先天愚型兒，也是由卵細(xì)胞染色體異常所引起，但其發(fā)病機(jī)制還不十分清楚。已證實(shí)實(shí)驗(yàn)用鼠的Wapl位于粗線期的精母細(xì)胞聯(lián)會(huì)復(fù)合體。且已證實(shí)實(shí)驗(yàn)用鼠的Wapl位于粗線期的精母細(xì)胞SC[3]。目前已證實(shí)SC的形成或解體與同源染色體正常分離有密切相關(guān)性[1，5-6]。在缺乏SYCP3的條件下，實(shí)驗(yàn)鼠的卵細(xì)胞由于SYCP3缺陷的誘導(dǎo)致使減數(shù)分裂染色體錯(cuò)誤隔離而產(chǎn)生非整倍體配子[7]。有研究[10-11]證實(shí)人類Wapl是一種黏性結(jié)合蛋白質(zhì)，它能促進(jìn)姊妹染色單體在有絲分裂前期分離。Wapl在Hela細(xì)胞的消耗能導(dǎo)致早中期類的細(xì)胞堆積，這些細(xì)胞染色體的姊妹染色單體極少分離，相反，Wapl的過(guò)度表達(dá)能引起姊妹染色單體在成熟前期分離，它提示W(wǎng)apl在減數(shù)分裂中同黏性結(jié)合蛋白質(zhì)（染色體精確分離所必須的蛋白質(zhì)）一樣起著調(diào)解染色體分離的作用。在本研究中我們首次證實(shí)在實(shí)驗(yàn)鼠卵細(xì)胞中Wapl與SC重疊分布，與在粗線期的精母細(xì)胞的Wapl與SC重疊分布相一致[3]。這些結(jié)果預(yù)示W(wǎng)apl參與減數(shù)分裂中染色體的組裝過(guò)程。

Wapl表達(dá)異常可能干擾實(shí)驗(yàn)鼠生殖細(xì)胞正常分裂與成熟，Wapl與SC的確切的分子結(jié)構(gòu)關(guān)系以及Wapl在人類不孕不育疾病中發(fā)病機(jī)制有待以后進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSIONOFWINGSAPART-LIKEPROTEINLOCALIZATIONONSYNAPTONEMALCOMPLEXINMOUSEOOCYTES

ZHANGJinwen1,DUChunhai2,WANGRan3
（1.DepartmentofVascularSurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;2.DepartmentofSurgery,theJingxianRenminHospital,HebeiProvince,Jingxian053500,China;3.Departmentof
ClinicalLaboratory,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China）

ObjectiveInordertoanalyzethecorrelationofthewingsapart-like（Wapl）proteinandthesynaptonemalcomplex（SC）ofpachyteneoocytes.MethodsThepachyteneoocyteswereisolatedfromfoetalmiceovariesat18.5danddoubleimmunostainedwithanti-synaptonemalcomplexprotein2 （SYCP2）andanti-Wapl.ResultsInthepachyteneoocytesexamined,mouseWaplwascolocalizedwithSYCP2ontheSC.ConclusionWaplmaybeapartofpachyteneoocyteSC.

zygote；synaptonemalcomplex；proteins；rats

2014-01-08；

2014-04-02

張金文（1960-），男，河北景縣人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事血管外科疾病診治研究。

R349.64

A

1007-3205（2014）05-0527-03

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.011