蔚曉暉，劉 偉

鄭州大學(xué)生物工程系生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋對人H7N9流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制作用

蔚曉暉，劉 偉#

鄭州大學(xué)生物工程系生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

#通訊作者，男，1967年7月生，博士，教授，研究方向：生物信息學(xué)與藥物設(shè)計，E-mail: weiliu@zzu.edu.cn

H7N9流感病毒；神經(jīng)氨酸酶；分子動力學(xué)；分子對接

H7N9流感病毒屬于甲型流感病毒，是一種新亞型流感病毒，2013年3月首次在人類中檢測出[1-2]。目前尚未有明顯證據(jù)表明該病毒可以在人與人之間傳播[3]，但H7N9病毒之間的遺傳變化表明其病毒較易傳播給人類，并且和SARS一樣可導(dǎo)致嚴重的呼吸道癥狀及死亡[4]。目前較常用的抗流感病毒藥物主要有奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋，它們可以通過抑制神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)來抑制流感病毒的繁殖。NA是一種流感病毒糖蛋白，能催化水解唾液酸末端的N-乙酰基神經(jīng)氨酸與鄰近寡糖D-半乳糖或是D-氨基半乳糖之間的α(2,6) 或α(2,3) 糖苷鍵，使成熟的病毒顆粒最終脫離宿主細胞，感染新的上皮細胞，造成流感病毒在患者體內(nèi)的擴散。雖然甲型流感病毒NA活性中心的結(jié)構(gòu)在流感病毒中是較為保守的，但流感病毒基因易重組突變，NA活性位點上氨基酸殘基的改變有可能使病毒對NA抑制劑產(chǎn)生明顯抗藥性[5-6]。因此，對NA藥物抑制特性的研究有助于對人感染H7N9流感病毒的防控工作。作者利用同源建模和分子對接方法，通過對藥物分子與H7N9 NA結(jié)合能的比較，分析藥物分子對NA的抑制作用。

1 材料與方法

1.1序列比對與同源建模從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得所有H7N9流感病毒NA的完整序列，包括6條人感染H7N9流感病毒NA序列，利用clustalx進行序列比對。選取人感染H7N9流感病毒A/Hangzhou/1/2013的NA序列(NCBI序列號：AGI60300.1, AGI)和其他來源H7N9流感病毒株A/wild bird/Korea/A3/2011的NA序列(NCBI序列號：AEK84752.2, AEK)進行同源建模。同源建模采用CPHmodels-3.2網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器[7]，可獲得對應(yīng)序列的三維空間結(jié)構(gòu)。

1.2分子動力學(xué)平衡分子動力學(xué)模擬采用Amber11，蛋白質(zhì)力場采用ff99力場[8]。NA模型在進行動力學(xué)模擬之前還需要利用Xleap程序進行處理，包括增加氫原子、增加抗衡離子以使體系中性化以及增加8.5 μm厚的基于TIP3P模型的八面體水環(huán)境。分子動力學(xué)過程優(yōu)化分為兩個階段：首先約束溶質(zhì)，對溶劑分子進行優(yōu)化；再無約束優(yōu)化整個系統(tǒng)。每個階段均采用最陡下降法優(yōu)化2 500步，再采用共軛梯度法優(yōu)化2 500步。優(yōu)化之后用60 ps時間使系統(tǒng)緩慢升溫到298 K，在298 K下進行500 ps的體系平衡過程，平衡之后再進行1.5 ns分子動力學(xué)模擬，最后選取體系能量最低的構(gòu)像狀態(tài)作為NA的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。按上述方法處理，分別獲得AGI和AEK的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

1.3分子對接模擬從PDB數(shù)據(jù)庫里獲得野生型流感H5N1病毒NA與奧司他韋復(fù)合物(WT-OTV, PDB Code: 2HU4)的結(jié)構(gòu)作為模板，然后將WT-OTV分別與平衡后的AGI和AEK的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)進行疊加，刪除WT-OTV的NA,分別得到了AGI、AEK與奧司他韋復(fù)合物(AGI-OTV、AEK-OTV)的結(jié)構(gòu)。同法獲得AGI、AEK分別與扎那米韋和帕拉米韋復(fù)合物(AGI-ZNV、AEK-ZNV和AGI-PRV、AEK-PRV)的結(jié)構(gòu)。對獲得的6種復(fù)合結(jié)構(gòu)，分別采用Autodock 4.0 程序[9]進行分子對接。對接選用的格點盒子大小為40點×40點×40點，格點間距0.375埃。運用Lamarckian 遺傳算法，對小分子進行100次的獨立對接實驗，能量極大值設(shè)為2.5×106，最大變異代數(shù)設(shè)為27 000，最后得到這些復(fù)合物與藥物小分子的結(jié)合能。

2 結(jié)果與討論

6條人感染H7N9病毒NA均出自長三角地區(qū)，序列比對的結(jié)果表明，序列相似度很高，而且在活性位點均未發(fā)生變異，由此初步判斷這次人感染H7N9病毒NA結(jié)構(gòu)比較保守。除人感染H7N9流感病毒NA序列外，只有AEK序列在第118位活性位點發(fā)生了R到T的突變。

在分子動力學(xué)模擬過程中，為了判斷體系是否平衡，分別計算了動能、勢能、總能和NA的主鏈Cα原子的RMSD值。RMSD是指體系在模擬過程中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)相對于晶體結(jié)構(gòu)隨時間變化的均方根偏差，也是衡量體系是否穩(wěn)定的重要依據(jù)。圖1表示的是NA主鏈Cα原子的RMSD值隨時間的變化值，其中，橫坐標(biāo)表示的是時間，縱坐標(biāo)表示的是RMSD值，由圖中可以看出時間大于350 ps以后，AGI和AEK的主鏈Cα原子的RMSD值達到1.5埃左右并保持平衡。同時體系動能、勢能和總能的變化迅速達到穩(wěn)定值，AGI的動能、勢能和總能分別保持在62 760、-292 880、-230 120 kJ/mol，AEK分別保持在83 680、-376 560、-292 880 kJ/mol，表明AGI和AEK在500 ps的動力學(xué)模擬過程中都達到了平衡，因此，可從模擬的最后階段選取NA的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

圖1 NA的主鏈Cα原子在平衡階段的動力學(xué)模擬的RMSD值變化

AGI和AEK與奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋的結(jié)合能如表1所示。從表1可以看出，奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋對AGI的抑制作用比較明顯；而AEK與藥物分子的結(jié)合能力較AGI略大，第118位活性位點R到T的突變并未減弱藥物分子對AEK的抑制作用。3CL2是通過對NA和奧司他韋晶體結(jié)構(gòu)(PDB Code: 3CL2)直接計算獲得的數(shù)值，該值直接反映了3CL2和奧司他韋之間較強的相互作用[10]，其與奧司他韋的結(jié)合能與AGI和AEK接近。上述結(jié)果說明奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋對人感染H7N9病毒株NA的抑制作用比較明顯。

表1 AGI和AEK與奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋的結(jié)合能 kJ/mol

綜上所述，人流感H7N9病毒株NA序列變化小，結(jié)構(gòu)比較保守，未發(fā)生活性位點突變；藥物分子對其的抑制作用明顯，因此對H7N9流感病毒在體內(nèi)釋放會有較好的抑制效果。但AEK活性位點的突變說明H7N9 NA有可能產(chǎn)生抗藥性突變，需引起關(guān)注。

[1]Alcorn, T. As H7N9 spread in China, experts watch and wait[J]. Lancet, 2013, 381(9875): 1347

[2]張寶,黃克勇,郭勁松,等.H7N9病毒的來源和重組模式[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,33(7):1017

[3]Horby P.H7N9 is a virus worth worrying about[J].Nature,2013,496(7446):399

[4]From SARS to H7N9: will history repeat itself?[J]. Lancet, 2013, 381(9875):1333

[5]Colman PM, Varghese JN, Laver WG. Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virus neuraminidase[J]. Nature, 1983, 303(5912): 41

[6]McKimm-Breschkin JL. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors:a review[J].Antiviral Res, 2000, 47(1) : 1

[7]Nielsen M, Lundegaard C, Lund O, et al. CPHmodels-3.0-Remote homology modeling using structure guided sequence profiles[J]. Nucleic Acids Research, 2010, 38(Web Serve issue): W576

[8]Duan Y, Wu C, Chowdhury S, et al. A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations[J]. J Comput Chem, 2003, 24(16): 1999

[9]Morris G, Goodsell D, Halliday R, et al. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function[J]. J Comput Chem, 1998, 19(14): 1639

[10]Collins PJ,Haire LF, Lin YP，et al. Crystal structures of oseltamivir-resistant influenza virus neuraminidase mutants[J]. Nature, 2008, 453(7199):1258

(2013-08-15收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.046