馮悅靜,魏小玲,尤愛(ài)國(guó),周安燕,吳擁軍,王 威,何其棟,王 靜#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室 鄭州 450001 3)河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 鄭州 450016

肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表達(dá)*

馮悅靜1),魏小玲2),尤愛(ài)國(guó)3),周安燕1),吳擁軍2),王 威2),何其棟2),王 靜1)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室 鄭州 450001 3)河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 鄭州 450016

#通訊作者，女，1958年11月生，博士，教授，研究方向：肺癌的發(fā)病機(jī)制和早期預(yù)警，E-mail:wangjing@zzu.edu.cn

肺,腫瘤；DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶；組蛋白去乙?；?

目的：研究肺癌患者血清中DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)1、DNMT3a、DNMT3b和組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)蛋白的表達(dá)情況。方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法測(cè)定136例肺癌患者、140例肺良性疾病及145例健康體檢者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表達(dá)，并分析DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果3組血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.281、62.510、37.273、57.721，P<0.05)，肺癌患者均高于正常對(duì)照及肺良性疾病患者；非條件logistic回歸分析提示DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白高表達(dá)均可影響肺癌的發(fā)生發(fā)展(P<0.001)；肺癌患者血清中DNMT1、DNMT 3a、DNMT 3b和HDAC1蛋白表達(dá)無(wú)組織學(xué)類型特異性(P>0.05)，但不同臨床分期其蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.843、0.244、0.222、0.878，P<0.05)。結(jié)論肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的高表達(dá)可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。

表觀遺傳學(xué)是近年來(lái)研究肺癌發(fā)生的熱點(diǎn)，包括基因組DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA調(diào)控(miRNA)等。DNA甲基化是通過(guò)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化完成的[1]。組蛋白去乙?；?(histone deacetylases 1,HDAC1)是Taunton等[2]發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)哺乳動(dòng)物的組蛋白去乙酰化酶，它是多種蛋白質(zhì)復(fù)合物的催化亞單位，參與組蛋白乙?；降恼{(diào)控。兩者異常導(dǎo)致的基因組穩(wěn)定性下降、抑癌基因功能喪失、原癌基因活性增高在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。新近研究[3-5]發(fā)現(xiàn)DNMT及HDAC1抑制劑在腫瘤治療中療效顯著，提示DNMT及HDAC1蛋白表達(dá)在腫瘤研究中有重要價(jià)值。既往研究多集中于肺癌組織中HDAC1和DNMTs蛋白表達(dá)。該研究通過(guò)ELISA方法檢測(cè)DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在肺癌、肺良性疾病患者及正常人血清中的表達(dá)，探討其可能的臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象136例肺癌患者來(lái)自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，其中男70例，女66例，年齡36～74(60.6±9.6)歲；吸煙者74例，不吸煙者62例；組織學(xué)類型：鱗癌53例，腺癌35例，其他48例。TNM分期(2009年肺癌國(guó)際分期修訂版)：Ⅰ期21例，Ⅱ期80例，Ⅲ期23例，Ⅳ期12例；患者均未接受放、化療和免疫治療。全部患者均經(jīng)病理學(xué)確診。140例肺良性病變患者來(lái)自鄭州市第六人民醫(yī)院肺科,其中男71例，女69例，年齡29～76(56.8±18.8)歲；吸煙者77例，不吸煙者63例；肺結(jié)核69例，慢性支氣管炎12例，肺部感染26例，支氣管擴(kuò)張23例，支氣管哮喘 10例。145例正常對(duì)照者為同期鄭州市第六人民醫(yī)院體檢科體檢的健康人，其中男75 例，女70例，年齡31～71(57.7±19.1)歲；吸煙者79名，不吸煙者66名。該研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和鄭州市第六人民醫(yī)院臨床倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2標(biāo)本收集所有研究對(duì)象均于清晨空腹抽取靜脈血3 mL，置于干燥管內(nèi)，37 ℃水浴30 min，然后3 000 r/min、4 ℃下離心3 min，取血清于EP管中，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)錅y(cè)。

1.3血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。Wellscan MK3酶標(biāo)儀、Wellwash MK2洗板機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；96孔可拆式酶標(biāo)板(浙江省臨海市化為分析器有限公司)；離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；DHP-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市光明醫(yī)療儀器廠)；DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1 ELISA試劑盒(北京鼎國(guó)生物研究有限公司)。具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 12.0進(jìn)行分析。收集受試者吸煙史等，其中吸煙定義為每天吸煙≥1支，持續(xù)半年以上[6]。3組受試者血清和不同臨床病理特征肺癌患者DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白表達(dá)的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)；采用非條件logistic回歸分析血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白表達(dá)與肺癌危險(xiǎn)性的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組受試者血清DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白的表達(dá)水平見(jiàn)表1。

表1 3組受試者血清DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白表達(dá)水平 μg/L

*:與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#：與肺良性病變組比較，P<0.05。

2.2肺癌的影響因素分析相關(guān)變量的賦值見(jiàn)表2(蛋白按對(duì)照組的中位數(shù)為分界點(diǎn))。年齡、性別、吸煙史及血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1水平高均是肺癌發(fā)生發(fā)展的影響因素，見(jiàn)表3。

表2 變量與賦值

表3 肺癌影響因素的非條件logistic回歸分析結(jié)果

2.3不同臨床病理特征肺癌患者血清HDAC1和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)的比較見(jiàn)表4。

表4 不同臨床病理特征肺癌患者HDAC1和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)的比較 μg/L

3 討論

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，DNA甲基化是通過(guò)DNMT催化作用，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶核苷酸的嘧啶環(huán)第5位碳原子甲基化，形成CpG島[1]。目前發(fā)現(xiàn)DNMT家族，尤其是DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在DNA初始甲基化及甲基化維持中發(fā)揮重要作用[7-9]，其活性的異常參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，是導(dǎo)致抑癌基因發(fā)生甲基化的重要因素。Lin等[10]研究已證實(shí)在腫瘤組織中抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與DNMT蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)，在多種腫瘤中都明顯升高，尤其在有吸煙史肺癌患者中，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表達(dá)顯著增高，并且DNMT1蛋白高表達(dá)的患者預(yù)后不良。Kim等[11]對(duì)102例非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNMT1和DNMT3b mRNA表達(dá)提高，同時(shí)檢出相關(guān)抑癌基因高甲基化。與異常甲基化類似，組蛋白修飾在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中同樣扮演重要角色。組蛋白乙?；氖Ш鈱⒁鹣鄳?yīng)的染色體結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄水平的改變，并影響細(xì)胞周期、細(xì)胞分化及凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。HDAC1使組蛋白去乙酰化，與DNA緊密結(jié)合，染色質(zhì)呈致密卷曲的阻抑結(jié)構(gòu)，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。Sasaki等[12]在102例NSCLC標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)Ⅲ期和Ⅳ期患者的HDAC1蛋白的表達(dá)明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，而在腫瘤和鄰近非腫瘤組織中的表達(dá)無(wú)明顯差別。

該研究結(jié)果顯示肺癌組血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表達(dá)均高于正常人及肺良性疾病患者。與劉啟明[13]的研究結(jié)果相一致，提示DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在肺癌的發(fā)生中可能起重要作用。

該研究非條件logistic回歸分析結(jié)果提示，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白高表達(dá)均是肺癌的影響因素，這與DNMT1在其他惡性腫瘤如肝癌、肺腺癌、腎癌[14]、卵巢癌[15]中表達(dá)的研究結(jié)果相一致。

另外，該研究還分析了DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在肺癌不同組織學(xué)類型及分期中的表達(dá)，結(jié)果顯示不同組織學(xué)類型的肺癌DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異。Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表達(dá)水平明顯高于Ⅲ、Ⅳ期。與孫云暉等[16]的報(bào)道一致。提示DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白高表達(dá)可能是肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要分子事件。

總之，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制究竟如何，尚需進(jìn)一步的研究。

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(2013-08-07收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Expressions of DNMT1,DNMT3a,DNMT3b and HDAC1 in serum from patients with lung cancer

FENGYuejing1),WEIXiaoling2),YOUAiguo3),ZHOUAnyan1),WUYongjun2),WANGWei2),HEQidong2),WANGJing1)

1)DepartmentofRespiratoryDisease,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofToxicology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

3)InstituteofInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016

lung，neoplasm;DNA methyltransferase;histone deacetylases 1

Aim: To study the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 in serum from patients with lung cancer. Methods: ELISA was used to measure the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 in the serum from 136 lung cancer patients,140 cases of lung benign diseases and 145 healthy people (control group), and the relationship between the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, HDAC1 and clinical characteristics of lung cancer was analyzed. Results:The expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 in patients with lung cancer were higher than those in lung benign diseases group and control group(F=3.281，62.510，37.273，57.721，P<0.05). The result of logistic regression showed that the overexpressions of DNMT1, DNMT3a，DNMT3b and HDAC1 might increase the risk of lung cancer (P<0.001). There were no correlations among the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b or HDAC1 between different histological types (P>0.05)，while there were statistical significances in the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 between different stages (t=0.843，0.244，0.222，0.878，P<0.05).Conclusion: The overexpressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 could contribute to the occurrence and development of lung cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.008

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30972457；河南省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目 112102310102

R734.2