劉 穎，周瑞敏，趙玉玲，趙旭東，許汴利，張紅衛(wèi)

河南省疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病所 鄭州 450016

河南省間日瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白基因序列分析*

劉 穎，周瑞敏，趙玉玲，趙旭東，許汴利，張紅衛(wèi)#

河南省疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病所 鄭州 450016

#通訊作者，男，1969年9月生，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：寄生蟲病防治，E-mail:zhwei69@163.com

河南；間日瘧原蟲；環(huán)子孢子蛋白；基因型

目的：探討河南省間日瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(CSP)的基因型分布。方法收集經(jīng)鏡檢確診的河南省2011年間日瘧患者血標(biāo)本34份，24例患者為河南籍，發(fā)病前無外出到其他省份或國(guó)家的歷史，10例患者有明確外出史。用核酸提取試劑盒提取濾紙血中瘧原蟲DNA，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定和基因進(jìn)化特征分析。結(jié)果24份本地病例分離所得的本地株間日瘧原蟲CSP均屬于PV-Ⅰ型，又可分為A和B 2個(gè)基因型；氨基酸同源性分析結(jié)果顯示，A型與VK210的同源性達(dá)90.6%～94.2%，B型為71.6%。結(jié)論河南省間日瘧原蟲CSP的基因型均屬PV-Ⅰ型，可以進(jìn)一步分為2個(gè)基因型，與其他國(guó)家的基因型顯著不同。

瘧疾是以按蚊為傳播媒介的重要蟲媒傳染病。間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax,P.vivax)廣泛分布于亞洲、南美洲的多個(gè)地區(qū)[1-2]，包含許多株、型，不同地理株瘧原蟲的生物學(xué)特性、對(duì)媒介按蚊的感染力、對(duì)人類宿主的免疫原性以及對(duì)抗瘧藥物的敏感性都有明顯的差異，并直接影響間日瘧的流行過程，關(guān)系到防治策略和措施的制定[3]。河南省歷史上曾是瘧疾高發(fā)區(qū)，20世紀(jì)70年代發(fā)病率達(dá)到17%[4],經(jīng)過廣大瘧疾防治工作者幾十年的艱苦努力，全省瘧疾發(fā)病已降至較低水平[5]，到2012年已無本地病例報(bào)告，但是輸入性病例在持續(xù)增加，傳播媒介依然存在，這些輸入性病例不但會(huì)成為重要的傳染源而引起間日瘧的再度流行[6]，還可能會(huì)引起不同地理株瘧原蟲基因的重組，使間日瘧原蟲種群復(fù)雜化[7]，也使得河南省的瘧疾防治工作面臨新的挑戰(zhàn)。間日瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(circumsporozoite protein，CSP)中央重復(fù)單元具有種屬特異性，是研究得較深入、應(yīng)用較頻繁的一個(gè)基因分型標(biāo)志[8]。為了解河南省間日瘧原蟲的基因型特點(diǎn)，作者對(duì)河南省2011年經(jīng)鏡檢確診的間日瘧患者的瘧原蟲分離株進(jìn)行了CSP基因序列分析，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源2011年1月～12月，在河南省全省范圍內(nèi)共收集到34份經(jīng)鏡檢確診為間日瘧患者的血標(biāo)本,均來自河南省瘧疾參比實(shí)驗(yàn)室。其中24例患者是河南籍，分別來自周口、南陽、商丘、駐馬店，發(fā)病前沒有外出到其他省份或國(guó)家的歷史，被視為“本地病例”，其瘧原蟲分離株稱為“本地株”；10例發(fā)病前有明確的外出至柬埔寨、緬甸、騰沖、印度的歷史，被視為“輸入病例”，其瘧原蟲分離株稱為“輸入株”。

1.2試劑及設(shè)備Go Taq Green Master Mix試劑購自Promage公司，瓊脂糖購自TaKaRa公司。核酸提取試劑盒購自Qiagen公司，PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)為Bio-RAD公司產(chǎn)品。

1.3CSP基因型的檢測(cè)

1.3.1 DNA提取 將血樣制作成濾紙血，常溫干燥后，-4 ℃保存?zhèn)溆?。用核酸提取試劑盒提取濾紙血中瘧原蟲DNA，按照說明書操作，獲得的DNA于-20 ℃保存。

1.3.2 引物 針對(duì)間日瘧原蟲CSP基因，參照文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)引物。第一輪引物序列：上游引物(F1)5’-ATGTAGATCTGTCCAAGGCCATAAA-3’，下游引物(R1)5’-TAATTGAATAATGCTAGGACTAACAATATG-3’。第二輪引物序列：上游引物(F2)5’-GCAGAAC CAAAAAATCCACGTGAAAATAAG-3’，下游引物(R2)5’-CCAACGGTAGCTCTAACTTTATCTAGGTAT-3’。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 巢式PCR 擴(kuò)增反應(yīng)分兩輪進(jìn)行。第一輪：擴(kuò)增體系為2×PCR Master Mix 10 μL，模板DNA 1 μL，引物F1、R1(10 mol/L)各1 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃ 4 min;95 ℃ 1 min,58 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩５诙啠阂缘谝惠啍U(kuò)增產(chǎn)物為模板。反應(yīng)體系為2×PCR Master Mix 20 μL，第一輪產(chǎn)物2 μL, 引物F2、R2(10 mol/L)各2 μL,用ddH2O補(bǔ)至40 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃ 4 min;95 ℃ 1 min,62 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3.4 測(cè)序分析 將第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，得到相關(guān)序列，使用ChromasPro軟件對(duì)正、反向序列進(jìn)行拼接，使用Bioedit對(duì)核苷酸序列進(jìn)行整理并轉(zhuǎn)換成氨基酸序列。從GenBank中調(diào)出VK210代表株M28746、VK247代表株M28745[4]、中國(guó)株U08977、印度株FJ491128、緬甸株AF316584的序列作為參考，用clustalx軟件對(duì)這些參考株與實(shí)驗(yàn)用分離株的序列進(jìn)行比對(duì)，分析其中央重復(fù)單元序列的多態(tài)性，并用Mega4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果34份血樣提取的DNA，經(jīng)二輪PCR擴(kuò)增后，均按照預(yù)期出現(xiàn)了一條750 bp左右的條帶,見圖1。

圖1 巢式PCR 擴(kuò)增間日瘧原蟲CSP基因結(jié)果

2.2氨基酸序列一致性分析見圖2。序列比對(duì)結(jié)果顯示，34株中共觀察到13個(gè)不同的序列，其中有33株的CSP中央重復(fù)單元為GDRA(A/D)GQPA，與VK210一致；有1株為NGAGNQPG，與VK247一致。其中本地株的序列均為VK210型，但序列間又存在不同，可進(jìn)一步分為7種。輸入株中共觀察到6個(gè)序列，1個(gè)與VK247一致，5個(gè)與VK210一致，且與本地株不同。

2.3同源性分析從所構(gòu)建的進(jìn)化樹(圖3)可以看出： 24個(gè)本地株均屬VK210型，但與VK210代表株M28746存在差異，可以分為基因型A和基因型B。基因型A可以進(jìn)一步劃分為A1、A2和A3 3個(gè)亞型。同源性分析結(jié)果(表1)顯示：A1、A2和A3亞型的同源性為93.0%～99.4%，與VK210代表株M28746的同源性為90.6%～94.2%，與中國(guó)株U08977(VK210型)的同源性為94.2%～97.7%，與VK247代表株M28745的同源性為16.2%～21.3%?；蛐虰與VK210代表株M28746的同源性為71.6%，與中國(guó)株U08977的同源性為72.3%，與VK247代表株M28745的同源性為38.3%。

圖2 序列比對(duì)

圖3 系統(tǒng)進(jìn)化樹

表1 本地株與其他株CSP的同源性 %

3 討論

間日瘧原蟲CSP中央重復(fù)單元氨基酸的組成有兩種：PV-Ⅰ型是全球普遍流行的優(yōu)勢(shì)型，其CSP中央重復(fù)單元類似VK210型，已報(bào)道的很多分離株都屬于此型；PV-Ⅱ型的CSP中央重復(fù)單元類似VK247型[10]。不同地區(qū)來源的間日瘧原蟲分離株顯現(xiàn)出明顯的多態(tài)性[11]，因此，分析CSP的序列可以檢測(cè)瘧原蟲的地理來源[1]。

此次研究采用巢式PCR法對(duì)河南省2011年的34份間日瘧患者的血樣做了初步分析，結(jié)果顯示： 34株中，只有一株來自騰沖的輸入株CSP中央重復(fù)單元是PV-Ⅱ型;其他33株全是PV-Ⅰ型，但重復(fù)單位的數(shù)目和位置不盡相同，24個(gè)本地株由20個(gè)及以上(20～22)的重復(fù)單位組成，9個(gè)輸入株由20個(gè)以下(17～19)的重復(fù)單位組成。24個(gè)本地株與10個(gè)輸入株的CSP中央重復(fù)單元九肽重復(fù)單位的數(shù)目、類型、位置差異均非常顯著。24個(gè)本地株的序列可以分為兩個(gè)基因型：基因型A與VK210代表株、中國(guó)株的同源性都在90%以上，與VK247代表株的同源性在20%左右；基因型B與VK210代表株、中國(guó)株的同源性則在72%左右，與VK247代表株的同源性為38.3%。

通過以上分析，作者認(rèn)為可以使用CSP作為分子標(biāo)記來區(qū)分瘧疾病例是本地病例還是輸入病例。該研究選用的中國(guó)參考株U08977與河南省的CSP基因型差異很明顯，可能是因?yàn)閁08977采自廣西北部與貴州邊界[5]，該地與河南省在緯度、氣候等方面都存在很大的差異，而河南省與周邊省份的間日瘧原蟲CSP基因型是否存在差異，還有待于進(jìn)一步的研究。

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(2013-09-05收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Genetic sequence analysis of circumsporozoite protein ofPlasmodiumvivaxfrom Henan Province

LIUYing,ZHOURuimin,ZHAOYuling,ZHAOXudong,XUBianli,ZHANGHongwei

ParasiteDiseaseInstitute,CenterforDiseaseControlandPreventionofHenanProvince,Zhengzhou450016

Henan;Plasmodiumvivax;circumsporozoite protein;genotype

Aim:To explore circumsporozoite protein(CSP) genotypes structure ofPlasmodiumvivax(P.vivax) in Henan.Methods:Blood samples of 34 malaria patients from Henan Province in 2011 were collected to extract DNA,and amplified using nested PCR technique, and the product was sequenced and analyzed. Results:The results showed that the 24 specimens from Henan indigenous cases all belonged to PV-Ⅰ; amino acid homology analysis showed that the specimens could be divided into two genotypes: A and B, the sequence of type A showed 90.6%-94.2% homology to VK210, while type B showed 71.6%. Conclusion: TheP.vivaxCSP genotype of Henan all belongs to PV-Ⅰ, and it can be further divided into two genotypes, which is significantly different from other countries.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.004

*河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 092102310007

R382.3