武俊芳，牛 杰，李曉鵬，張芬熙，林俊堂，任同明，汪艷麗

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室 新鄉(xiāng) 453003 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院眼科 新鄉(xiāng) 453003 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院解剖學(xué)教研室 新鄉(xiāng) 453003 4)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院干細胞與生物治療研究中心 新鄉(xiāng) 453003 5)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)實驗室 新鄉(xiāng) 453003

氧化型低密度脂蛋白對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞遷移的影響*

武俊芳1)，牛 杰1)，李曉鵬2)，張芬熙3,4)#，林俊堂4)，任同明5)，汪艷麗1)

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室 新鄉(xiāng) 453003 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院眼科 新鄉(xiāng) 453003 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院解剖學(xué)教研室 新鄉(xiāng) 453003 4)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院干細胞與生物治療研究中心 新鄉(xiāng) 453003 5)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)實驗室 新鄉(xiāng) 453003

#通訊作者，女，1978年8月生，碩士，講師，研究方向：干細胞研究，E-mail：fxzhang0824@gmail.com

氧化型低密度脂蛋白；骨髓間充質(zhì)干細胞；細胞遷移；細胞骨架；鈣離子；小鼠

目的：研究氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bmMSCs)遷移的影響。方法觀察小鼠bmMSCs對ox-LDL的攝取能力。應(yīng)用不同質(zhì)量濃度(0、5、10和20 mg/L)ox-LDL誘導(dǎo)培養(yǎng)bmMSCs 6 h后，利用Transwell系統(tǒng)檢測bmMSCs跨內(nèi)皮遷移率，流式細胞儀檢測ox-LDL細胞內(nèi)鈣離子陽性率，激光共聚焦顯微鏡檢測細胞骨架F-actin在細胞內(nèi)的分布。結(jié)果小鼠bmMSCs具有較強的攝取ox-LDL的能力。0、5、10和20 mg/L ox-LDL處理組bmMSCs跨內(nèi)皮遷移率分別為(26.663±1.575)%、(34.653±2.693)%、(38.238±3.050)%和(42.833±3.748)%，鈣離子陽性率分別為(42.375±4.281)%、(66.203±5.416)%、(77.958±4.338)%和(84.638±4.768)%，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.576、63.819，P<0.001)。ox-LDL可促進細胞骨架F-actin的重組。結(jié)論ox-LDL可通過調(diào)節(jié)細胞骨架重組和胞內(nèi)鈣離子陽性率促進bmMSCs的遷移。

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，bmMSCs)是一類具有多向分化潛能的多功能成體干細胞，在特定環(huán)境下可向多種功能細胞分化[1]。bmMSCs移植是目前生物醫(yī)學(xué)治療研究領(lǐng)域的重要課題。相關(guān)研究[1-3]顯示，bmMSCs移植對阿爾茨海默病、心肌梗死、中風(fēng)、骨腫瘤和肺損傷等多種疾病均有一定的療效。但近期研究[4]顯示，在靜脈注射后僅有不到1.5%的bmMSCs能遷移到病灶部位。細胞歸巢率低的問題大大限制了bmMSC移植的臨床應(yīng)用和療效。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)為一類體內(nèi)氧化型脂質(zhì)微粒，是誘導(dǎo)體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的主要因素之一[5]。凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體1(lectin-like ox-LDL receptor 1，LOX-1)是ox-LDL的主要受體之一[5]。作者的前期研究[6]結(jié)果顯示，LOX-1高表達于小鼠bmMSCs，且能介導(dǎo)間充質(zhì)干細胞攝取ox-LDL。相關(guān)研究[7]顯示，ox-LDL可通過活化LOX-1而活化細胞一系列生理信號，促進多種細胞的遷移。但ox-LDL是否影響小鼠bmMSCs的遷移目前還不清楚。該研究旨在探討ox-LDL對小鼠bmMSCs遷移的影響及其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1材料Fluo-3/AM，Rhodamine phalloidin和ProlongH Gold antifade reagent with DAPI購自Invitrogen公司(美國)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗和FITC標(biāo)記的CD90抗體均購自Abcam公司(美國)。ox-LDL和Dil標(biāo)記的ox-LDL購自Biomedical Technologies公司(美國)。HyClone血清購自Thermo Fisher Scientific公司(美國)。Transwell plates(8 μmol/L)購自Conning Costar公司(美國)。

1.3ox-LDL攝取實驗將第3代小鼠bmMSCs接種到24孔板中常規(guī)培養(yǎng)。24 h后，向培養(yǎng)基中添加5 mg/L Dil標(biāo)記的ox-LDL，培養(yǎng)箱中孵育30 min。PBS洗滌3次后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4細胞遷移實驗將4×104L-1的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)接種到Transwell的上室中，常規(guī)培養(yǎng)24 h；將經(jīng)不同質(zhì)量濃度(0、5、10和20 mg/L)ox-LDL誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后的bmMSCs接種到上室中，再培養(yǎng)6 h，計數(shù)遷移到小室下壁的細胞數(shù)量，并計算細胞跨內(nèi)皮遷移率。每組均設(shè)5個復(fù)孔。

1.5細胞內(nèi)鈣離子陽性率檢測將小鼠bmMSCs接種到6孔板中，分別用0、5、10和20 mg/L的ox-LDL誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。然后，向培養(yǎng)基中添加終濃度為5 μmol/L的Fluo-3/AM，避光37 ℃孵育30 min。PBS洗滌細胞3次，2.5 g/L胰蛋白酶消化并收集細胞。PBS洗滌1次后，將細胞懸浮于500 μL PBS中，吹打混勻，上流式細胞儀分析，計算熒光強度(鈣離子陽性率)。每組均設(shè)5個復(fù)孔。

1.6細胞骨架檢測將bmMSCs接種到24孔板中，立即用不同質(zhì)量濃度(0、5、10和20 mg/L)ox-LDL處理6 h。然后，PBS洗細胞2次，體積分數(shù)為4%中性福爾馬林固定細胞，Triton X-100處理細胞10 min，再利用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色檢測細胞骨架F-actin，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 11.5進行分析，應(yīng)用單因素方差分析和Turkey檢驗比較4組小鼠bmMSCs跨內(nèi)皮遷移率和鈣離子陽性率，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1小鼠bmMSCs的形態(tài)、鑒定及對ox-LDL的攝取免疫熒光染色顯示，小鼠bmMSCs陽性表達間充質(zhì)干細胞特異性標(biāo)記分子CD90(圖1A～C)。光鏡下，第3代小鼠bmMSCs呈典型的梭形或長梭形成纖維細胞形態(tài)(圖1D)。熒光檢測顯示，小鼠bmMSCs具有很強的攝取ox-LDL的能力(圖1E～F)。

圖1 小鼠bmMSCs的形態(tài)、鑒定及其對Dil-ox-LDL的攝取(×100)

A：DAPI染色顯示小鼠bmMSCs核形態(tài)； B：免疫熒光染色顯示CD90(FITC)在小鼠bmMSCs內(nèi)的表達；C：DPAI 熒光染色和FITC熒光染色的合成圖片；D：相差顯微鏡圖像顯示小鼠bmMSCs的形態(tài)；E：小鼠bmMSCs對Dil標(biāo)記的(紅色)ox-LDL的攝??；F：相差圖像和Dil熒光的合成圖片。

2.2不同質(zhì)量濃度ox-LDL培養(yǎng)對小鼠bmMSCs跨內(nèi)皮遷移率和鈣離子陽性率的影響見表1。如表1所示，與0 mg/L ox-LDL處理組比較，5、10和20 mg/L ox-LDL處理組bmMSCs跨內(nèi)皮細胞遷移率和鈣離子陽性率均顯著增加，且具有劑量效應(yīng)。

2.3ox-LDL對小鼠bmMSCs骨架F-actin的影響見圖2。ox-LDL可促進bmMSCs沿培養(yǎng)瓶壁伸展、生長，促進F-actin的重新組裝(F-actin纖維長度增加，且排列更有序)。

表1 不同質(zhì)量濃度ox-LDL培養(yǎng)對小鼠bmMSCs跨內(nèi)皮遷移率和鈣離子陽性率的影響(n=5)

*:與0 mg/L ox-LDL處理組相比，P<0.05；#:與5 mg/L ox-LDL處理組相比，P<0.05；△：與10 mg/L ox-LDL處理組相比，P<0.05。

圖2 ox-LDL對小鼠bmMSCs骨架F-actin的影響(×400)

3 討論

間充質(zhì)干細胞具有很強的可塑性，可向多種功能細胞分化，是細胞移植術(shù)中最常用的種子細胞。目前，bmMSC移植已廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，但預(yù)期療效并不理想，其中，移植后bmMSC歸巢率低是一個主要影響因素[4]。以往研究[7-8]顯示，ox-LDL可促進細胞趨化因子的表達和多種細胞的遷移。作者的研究結(jié)果顯示，小鼠bmMSCs具有很強的攝取ox-LDL的能力，經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)培養(yǎng)后的小鼠bmMSCs遷移能力顯著增加，且具有劑量效應(yīng)，這說明ox-LDL可調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞的生理功能。

細胞骨架結(jié)構(gòu)是細胞變形、運動和遷移的重要動力學(xué)基礎(chǔ)。動態(tài)性細胞骨架重組是細胞遷移的前提條件。細胞靠骨架的不斷解聚和重聚合，通過形成偽足，推動細胞向前移動。肌動蛋白纖維F-actin是細胞骨架的重要組成部分，該研究結(jié)果顯示ox-LDL可明顯促進F-actin在bmMSCs中的重組，使F-actin排列更加有序，這說明ox-LDL可促使接種后bmMSCs(消化后為圓形)沿培養(yǎng)瓶壁伸展、生長和細胞形態(tài)恢復(fù)。需要注意的是，其他課題組研究[9]顯示高質(zhì)量濃度ox-LDL(100 mg/L)也能造成其他種類細胞(如平滑肌細胞)的骨架結(jié)構(gòu)解聚，抑制細胞遷移和誘導(dǎo)細胞的凋亡。所以，在應(yīng)用ox-LDL誘導(dǎo)bmMSCs遷移時，要盡量控制ox-LDL的質(zhì)量濃度，避免過高含量對細胞遷移和其他生理功能的損傷。

細胞內(nèi)鈣離子是調(diào)節(jié)細胞遷移的另一個重要影響因素。此外，細胞內(nèi)鈣離子也是細胞骨架重組的調(diào)節(jié)因子，鈣離子介導(dǎo)的細胞遷移依賴于其對細胞骨架重組的調(diào)節(jié)作用[10]。以往研究[11]已證實，ox-LDL有促進細胞外鈣離子內(nèi)流的作用。該研究顯示，伴隨著細胞遷移能力的增加，細胞內(nèi)鈣離子的濃度也隨之增加，且具有劑量效應(yīng)。這說明，ox-LDL對bmMSCs遷移能力的影響可能依賴于其對細胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)。

總之，該研究顯示，ox-LDL可促進小鼠bmMSCs的遷移，該作用與其調(diào)節(jié)bmMSCs骨架結(jié)構(gòu)重組和細胞內(nèi)鈣離子濃度有一定關(guān)系。

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(2013-11-07收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Effect of oxidized low-density lipoprotein on migration of mouse bone marrow-derived stem cells

WUJunfang1),NIUJie1)，LIXiaopeng2)，ZHANGFenxi3,4)，LINJuntang4)，RENTongming5)，WANGYanli1)

1)LaboratoryofMorphology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003 2)DepartmentofOphthalmology,theThirdAffiliatedHospital，XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003 3)DepartmentofAnatomy,SanquanCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003 4)StemCellandBiotheraphyTechnologyResearchCenter,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003 5)LaboratoryofAnatomy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003

oxidized low-density lipoprotein;bone marrow mesenchymal stem cell;cell migration;cytoskeleton;calcium ion;mouse

Aim: To investigate the effect of oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL) on migration of mouse bone marrow mesenchymal stem cells(bmMSCs). Methods: bmMSCs were cultured in growth medium with different concentrations (0, 5, 10 and 20 mg/L) of ox-LDL for 6 hours. The transendothelial migration rate of bmMSCs was measured using a Transwell system. The distribution of F-actin in bmMSCs was detected using a laser scanning confocal microscope following Rhodamine phalloidin staining. The concentrations of calcium ion (Ca2+) in bmMSCs was measured using a flow cytometer following Fluo-3/AM staining. Results: bmMSCs had high potential to take up ox-LDL. The transendothelial migration rate was (26.663±1.575)%,(34.653±2.693)%, (38.238±3.050)% and (42.833±3.748)% in control group, 5, 10 and 20 mg/L ox-LDL groups; there was significant differences among control group and the other 3 ox-LDL groups(F=22.576，P<0.001). The flow cytometry analysis showed that the positive rate of Ca2+was (42.375±4.281)%,(66.203±5.416)%，(77.958±4.338)% and (84.638±4.768)% in control group, 5, 10 and 20 mg/L ox-LDL groups; there was significant difference among control group and the other 3 ox-LDL groups(F=63.819，P<0.001). Furthermore, ox-LDL also promoted reorganization of F-actin cytoskeleton. Conclusion: Ox-LDL can promote migration of bmMSCs via regulation of cytoskeleton organization and Ca2+positive rates.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.003

*河南省教育廳自然科學(xué)基金資助項目 2010A310006

R331