戴翠萍，張徐寧，薛彩萍，劉家秀，張玉領(lǐng)，楊學(xué)藝，陳文中，季寧東

1)淮陰衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)?；窗彩邢滥[瘤重點實驗室 淮安 223300 2)南京思科藥業(yè)有限公司 南京 210061

羥基喜樹堿脂質(zhì)體與順鉑聯(lián)用對耐順鉑的人食管癌Eca109細(xì)胞周期和凋亡的影響*

戴翠萍1)△，張徐寧1)，薛彩萍1)，劉家秀1)，張玉領(lǐng)1)，楊學(xué)藝1)，陳文中2)，季寧東1)

1)淮陰衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)?；窗彩邢滥[瘤重點實驗室 淮安 223300 2)南京思科藥業(yè)有限公司 南京 210061

△女，1972年10月生，碩士，副教授，研究方向：消化道腫瘤，E-mail：38224722@qq.com

羥基喜樹堿脂質(zhì)體；順鉑；食管癌；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

目的：研究羥基喜樹堿脂質(zhì)體(LHCPT)與順鉑(DDP)聯(lián)用對耐DDP的人食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞(Eca109/DDP)細(xì)胞周期和凋亡的影響。方法取對數(shù)生長期的Eca109/DDP細(xì)胞，分別用0、1 mg/L DDP處理，再用0.00、0.49、0.98、1.96、3.92、7.84 μg/L LHCPT處理72 h，MTT法測定細(xì)胞增殖狀況。取對數(shù)生長期的Eca109/DDP細(xì)胞，分別用0、1 mg/L DDP處理后，再用0.00、3.92 μg/L LHCPT處理72 h，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果相對于單獨應(yīng)用，LHCPT與DDP聯(lián)合應(yīng)用抑制了Eca109/DDP細(xì)胞的增殖(FLHCPT=40.330，F(xiàn)DDP=641.010，F(xiàn)交互=20.330，P均<0.001)，以3.92 μg/L LHCPT與1 mg/L DDP聯(lián)用效果最佳(P<0.05)。相對于單獨應(yīng)用，3.92 μg/L LHCPT與1 mg/L DDP聯(lián)用可阻滯Eca109/DDP細(xì)胞在G0/G1期(FLHCPT=16.184，F(xiàn)DDP=33.660，F(xiàn)交互=15.100，P均<0.05)，同時增加細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率(P均<0.05)，二者具有協(xié)同效應(yīng)。結(jié)論LHCPT具有輔助DDP治療食管癌的作用。

食管癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人體健康。順鉑(cisplatin，DDP)為臨床治療食管癌的主要化療藥物之一，但往往因多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)影響了其對耐藥細(xì)胞株的療效。研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤藥物的療效主要取決于其激活細(xì)胞凋亡的能力[1]，而脂質(zhì)體具有促進腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[2-3]，但未見羥基喜樹堿脂質(zhì)體(hydroxycamptothecin liposome，LHCPT)對食管癌耐藥細(xì)胞作用的研究報道。作者用耐DDP的食管癌細(xì)胞Eca109/DDP為模型，觀察LHCPT與DDP聯(lián)合應(yīng)用對Eca109/DDP細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，為將LHCPT用于臨床食管癌的輔助化療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要儀器、藥品和試劑LHCPT(南京思科藥業(yè)有限公司)，注射用DDP(規(guī)格5 g/L，山東齊魯制藥有限公司)，RPMI 1640(美國 Gibco公司)，MTT(美國 Amresco公司)，DMSO(上海久億化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。酶標(biāo)儀(美國 BioTek ELx800)，Western電泳儀(美國 Bio-Rad 164-5051)，高速冷凍離心機(德國 SORVALL D-37520)，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本 SANYO XD-101)，流式細(xì)胞儀(美國 FACS Calibur Becton-Dickinson)。

1.2細(xì)胞株食管癌細(xì)胞株Eca109購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，耐DDP食管癌細(xì)胞株Eca109/DDP由實驗室用遞增藥物質(zhì)量密度持續(xù)作用誘導(dǎo)法誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞6個月構(gòu)建而成，耐藥指數(shù)為15.89[4]。細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、飽和濕度及體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3LHCPT、DDP單用及聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞增殖影響的觀察取對數(shù)生長期的Eca109/DDP細(xì)胞，以2.5 g/L的胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104mL-1，5×103個/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，分別用0、1 mg/L的DDP處理，再用0.00、0.49、0.98、1.96、3.92、7.84 μg/L的LHCPT處理，每組5個復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，MTT法測定各孔吸光度(A)。

1.4LHCPT、DDP單用及聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡影響的觀察取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106mL-1，1×106個/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，分別用0、1 mg/L的DDP處理，再用0.00、3.92 μg/L的LHCPT處理，每組5個平行復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡情況[5]。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用析因設(shè)計的方差分析比較LHCPT、DDP單用及聯(lián)用對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡影響的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1LHCPT、DDP單用及聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞增殖的影響各組MTT法測得的A值見表1。結(jié)果顯示，相對于DDP單獨應(yīng)用，LHCPT與DDP聯(lián)用抑制了Eca109/DDP細(xì)胞的增殖，以3.92 μg/L LHCPT與1 mg/L DDP聯(lián)用效果最佳。

表1 LHCPT、DDP單用及聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞增殖的影響

FLHCPT=40.330，F(xiàn)DDP=641.010，F(xiàn)交互=20.330，P均<0.001。

2.2LHCPT、DDP單用及聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞周期的影響各組細(xì)胞周期測定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，相對于DDP單獨應(yīng)用，LHCPT與DDP聯(lián)用組G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，LHCPT與DDP具有協(xié)同效應(yīng)。

表2 LHCPT、DDP單用及聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞周期的影響 %

2.3LHCPT、DDP單用及聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞凋亡的影響各組細(xì)胞凋亡測定結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，相對于DDP單獨應(yīng)用，LHCPT與DDP聯(lián)用組Eca109/DDP細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均增加，LHCPT與DDP具有協(xié)同效應(yīng)。

表3 LHCPT、DDP單用及聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞凋亡的影響 %

3 討論

腫瘤的發(fā)生是多因素、多階段、多基因相互作用的結(jié)果，在生物學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡障礙和細(xì)胞周期調(diào)控機制的紊亂。研究[6-10]表明，誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡和周期改變可抑制食管癌細(xì)胞的增殖。因此選擇有效藥物誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡和周期改變是提高食管癌療效的關(guān)鍵因素之一。

脂質(zhì)體作為藥物載體在藥物傳遞系統(tǒng)中的研究較多，其本身對人體無毒性和免疫抑制作用，但具有明顯的靶向作用、緩釋作用、生物膜親和性和組織相容性、提高藥物穩(wěn)定性的特點。國內(nèi)外研究表明脂質(zhì)體具有促進細(xì)胞凋亡[2-3]和逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的作用[11-13]。作者將LHCPT與臨床一線抗癌藥DDP聯(lián)合應(yīng)用，觀察其對耐DDP的食管癌細(xì)胞Eca109/DDP的增殖抑制作用，并探討其機制。研究結(jié)果表明，LHCPT與DDP聯(lián)合應(yīng)用對Eca109/DDP細(xì)胞的增殖抑制有協(xié)同效應(yīng)，以3.92 μg/L LHCPT與1 mg/L DDP聯(lián)合應(yīng)用對Eca109/DDP細(xì)胞的增殖抑制作用最強。進一步對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果顯示，與單獨應(yīng)用相比，3.92 μg/L的LHCPT與1 mg/L DDP聯(lián)合應(yīng)用組G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，同時細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率、總凋亡率均顯著增加。研究結(jié)果說明LHCPT與DDP聯(lián)合應(yīng)用能誘使Eca109/DDP細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，通過改變Eca109/DDP細(xì)胞周期、增加細(xì)胞凋亡，從而抑制Eca109/DDP細(xì)胞的增殖，LHCPT與DDP有明顯的協(xié)同效應(yīng)。臨床上如果將LHCPT與DDP聯(lián)合應(yīng)用可起到提高DDP藥效、降低DDP用藥劑量的作用，這將有助于克服單獨應(yīng)用DDP所引起的毒副作用大、容易發(fā)生耐藥等缺點，兩藥聯(lián)用將會使DDP的應(yīng)用更加安全，低濃度的LHCPT具有輔助DDP治療食管癌的潛力。

目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡存在三條通路，即線粒體通路[14]、死亡受體通路[15]和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[16]，三條通路間密切關(guān)聯(lián)。其中，線粒體被視為細(xì)胞死亡調(diào)控的關(guān)鍵元件，是多種促細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的靶點。LHCPT與DDP聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞凋亡通路的影響將是進一步研究的方向，同時今后也要進一步加強兩藥聯(lián)用對食管癌實體瘤影響的研究。

[1]Schmitt CA.Senescence, apoptosis and therapy：cutting the lifelines of cancer[J]．Nat Rev Cancer，2003，3(4)：286

[2]Komizu Y，Ueoka H，Goto K，et al．Remarkable inhibitory effects of hybrid liposomes on growth of human colon cancer cells through induction of cell cycle arrest along with apoptosis[J]．Int J Nanomedicine，2011，6：1913

[3]Long Q，Xiel Y，Huang Y，et al．Induction of apoptosis and inhibition of angiogenesis by PEGylated liposomal quercetin in both cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant ovarian cancers[J]．J Biomed Nanotechnol， 2013，9(6)：965

[4]戴翠萍，張徐寧，薛彩萍，等.冰片與順鉑聯(lián)用對Eca109(DDPr)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響[J ].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013,33(10):1388

[5]劉靜容，姜旭，肖衛(wèi)．硫酸銦對L929細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響[J]．工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2012，38(2)：65

[6]Kim SJ，Lee JS，Kim SM．3,3'-Diindolylmethane suppresses growth of human esophageal squamous cancer cells by G1 cell cycle arrest[J]．Oncol Rep，2012，27(5)：1669

[7]He JK，Wu XS，Wang Y，et al．Growth inhibitory effects and molecular mechanisms of crotoxin treatment in esophageal Eca-109 cells and transplanted tumors in nude mice[J]．Acta Pharmacol Sin，2013，34(2)：295

[8]Liu D,Yang Y,Liu Q,et al.Inhibition of autophagy by 3-MA potentiates cisplatin-induced apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cells[J]．Med Oncol,2011,28(1):105

[9]朱愛蓮，王峰，樊青霞，等．復(fù)方苦參注射液對人食管鱗癌EC9706細(xì)胞凋亡及生長抑制的影響[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志，2011，91(39)：2797

[10]Xu Y,Wang G,Chen Q,et al.Intrinsic apoptotic pathway and G2/M cell cycle arrest involved in tubeimoside Ⅰ-induced EC109 cell death[J]．Chin J Cancer Res，2013，25(3)：312

[11]Riganti C，Voena C，Kopecka J，et al．Liposome-encapsulated doxorubicin reverses drug resistance by inhibiting P-glycoprotein in human cancer cells[J]．Mol Pharm，2011，8(3)：683

[12]Patel NR，Rathi A，Mongayt D，et al．Reversal of multidrug resistance by co-delivery of tariquidar(XR9576) and paclitaxel using long-circulating liposomes[J]．Int J Pharm，2011，416(1)：296

[13]周知午，周于祿．異鉤藤堿脂質(zhì)體逆轉(zhuǎn)人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP對順鉑耐藥的研究[J]．湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，28(3)：29

[14]Zhou Y，Peng Y，Mao QQ，et al．Casticin induces caspase-mediated apoptosis via activation of mitochondrial pathway and upregulation of DR5 in human lung cancer cells[J]．Asian Pac J Trop Med，2013，6(5)：372

[15]Yang J，Yang Y，Tian L，et al．Casticin-induced apoptosis involves death receptor 5 upregulation in hepatocellular carcinoma cells[J]．World J Gastroenterol，2011，17(38)：4298

[16]Wu LF，Wei BL，Guo YT，et al．Apoptosis induced by adenosine involves endoplasmic reticulum stress in EC109 cells[J]．Int J Mol Med，2012，30(4)：797

(2013-08-18收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effects of hydroxycamptothecin liposome combined with cisplatin on cell cycle and apoptosis of cisplatin-resistanted human esophageal carcinoma Eca109 cell

DAICuiping1),ZHANGXuning1),XUECaiping1),LIUJiaxiu1),ZHANGYuling1),YANGXueyi1),CHENWenzhong2),JINingdong1)

1)Huai’anKeyLaboratoryofTumorinDigestiveSystem,HuaiyinAdvancedVocationalandTechnicalHealthSchool,Huai’an223300 2)NanjingSikeMedicalCo.Ltd.，Nanjing210061

hydroxycamptothecin liposome;cisplatin;esophageal carcinoma;cell cycle;cell apoptosis

Aim: To investigate the effects of hydroxycamptothecin liposome(LHCPT) combined with cisplatin(DDP) on cell cycle and apoptosis of DDP-resistanted human esophageal carcinoma cell Eca109(Eca109/DDP).Methods:Eca109/DDP cells were treated with 0,1 mg/L DDP,and then treated with 0.00,0.49,0.98,1.96,3.92,7.84 μg/L LHCPT for 72 h, respectively;MTT method was applicated to detect the cell proliferation.Eca109/DDP cells were treated with 0,1 mg/L DDP,and then treated with 0.00,3.92 μg/L LHCPT for 72 h, respectively;flow cytometry was used to study the cell cycle and apoptosis.Results:Compared with single drug treatment, the growth inhibition effect on Eca109/DDP cells in LHCPT+DDP group was significant(FLHCPT=40.330，F(xiàn)DDP=641.010，F(xiàn)interaction=20.330，P<0.001),especially 3.92 μg/L LHCPT+1 mg/L DDP.Compared with single drug treatment, 3.92 μg/L LHCPT+1 mg/L DDP could significantly block Eca109/DDP cells at G0/G1phase(FLHCPT=16.184，F(xiàn)DDP=33.660，F(xiàn)interaction=15.100，P<0.05), and increase the early apoptotic rate，late apoptotic rate and total apoptotic rate(P<0.05).Conclusion: LHCPT has the potential to be an adjunct to chemotherapy for esophageal carcinoma.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.002

*江蘇省衛(wèi)生職業(yè)教育研究指導(dǎo)性項目 JZ200911;淮安市科技支撐計劃項目 HAS2009002-5

R735.1