郭愛葉，丁胭脂，張 虎，張紅新，陳奎生#

1)河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450003 2)河南省腫瘤醫(yī)院病理科 鄭州 450003 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科；河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

SmosiRNA對人食管癌EC9706細(xì)胞凋亡及Smo、bcl-2基因表達(dá)的影響*

郭愛葉1)，丁胭脂2)，張 虎3)，張紅新3)，陳奎生3)#

1)河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450003 2)河南省腫瘤醫(yī)院病理科 鄭州 450003 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科；河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

#通訊作者，男，1964年8月生，博士，教授，研究方向：腫瘤病理，E-mail:chenksh2002@163.com

Smo；bcl-2；食管癌；凋亡

目的：探討Smo siRNA對人食管癌EC9706細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)的影響。方法設(shè)計(jì)并合成Smo siRNA-3，轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細(xì)胞后，分別采用RT-PCR和Western blot法檢測細(xì)胞中Smo、bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)；采用TUNEL法及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，分析凋亡指數(shù)(AI)和凋亡細(xì)胞比例。以未轉(zhuǎn)染、無關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞作對照。結(jié)果與各對照組相比，Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染細(xì)胞24、48和72 h后EC9706細(xì)胞中Smo、bcl-2 mRNA的表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，以轉(zhuǎn)染72 h降低最顯著(P<0.05)。與各對照組相比，Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞中Smo、bcl-2蛋白的表達(dá)均明顯降低(F=151.310、143.190，P<0.001)，AI增加(F=66.270，P<0.001)，早期和晚期凋亡細(xì)胞比例均增加(F=101.100、334.990，P<0.001)。結(jié)論Smo siRNA可能通過抑制細(xì)胞中Smo基因表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)bcl-2表達(dá)，促進(jìn)EC9706細(xì)胞凋亡。

Hedgehog(Hh)信號通路是調(diào)控細(xì)胞增殖和組織分化的重要信號通路，Smoothened(Smo)蛋白是Hh信號通路上的膜蛋白，它把細(xì)胞外的Hh信號轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的Gli信號, 進(jìn)而激活Hh相應(yīng)基因(如bcl-2等)的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞凋亡[1]。該研究中作者觀察了RNA干擾沉默Smo基因?qū)θ耸彻荀[狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706凋亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，以期為食管癌的基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料EC9706細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈送。LipofectamineTM2000及Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒購自Fermentas公司，Quant cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，Smo、bcl-2、β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成，RPMI 1640培養(yǎng)液由北京索萊寶科技有限公司提供，TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司，Smo、β-actin一抗及bcl-2兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。Smo siRNA(包括3條不同的Smo siRNA、無關(guān)序列siRNA)由上海吉瑪公司合成，序列見表1。

表1 3條Smo siRNA 的序列

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將EC9706細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，青、鏈霉素各100 U/mL)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組將EC9706細(xì)胞以4.5×105mL-1的密度接種于6孔板中，細(xì)胞覆蓋率達(dá)30%～50%時(shí)，利用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染3條Smo siRNA，結(jié)果Smo siRNA-3的抑制效率最好，故選擇Smo siRNA-3用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染24、48、72 h組，無關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染試劑組和未轉(zhuǎn)染對照組，每組5個(gè)復(fù)孔。

1.4細(xì)胞中Smo、bcl-2mRNA的RT-PCR法檢測收集上述6組細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。Smo 上游引物序列為5’-CGCTACCCTGCTGT TATTCTCT-3’，下游引物序列為5’-CAGGTGGAAG TAGGAGGTCTTG-3’,產(chǎn)物大小為306 bp；bcl-2上游引物序列為5’-AACTCGAGTGACAAGCCCGATG-3’，下游引物序列為5’-GTACCACCAGTTGGTTGTCTTT GA-3’,產(chǎn)物大小為201 bp；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5’-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3’，下游引物序列為5’-GAGCTACGAGCTGCTGCCTGACG-3’,產(chǎn)物大小為416 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，63 ℃(Smo)/68 ℃(bcl-2)/67 ℃(β-actin)退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Alpha多功能凝膠成像系統(tǒng)成像，用Alpha View軟件進(jìn)行圖像分析，以目的基因與β-actin電泳條帶吸光度(A)值的比值表示目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.5細(xì)胞中Smo、bcl-2蛋白的Westernblot法檢測收集Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染72 h組、無關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染試劑組和未轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化離心，冰上裂解，提取蛋白質(zhì)，采用BCA法測定蛋白濃度，Western blot法檢測Smo、bcl-2蛋白。一抗按1 000倍稀釋，二抗按5 000倍稀釋。DAB顯色。圖像分析同1.4，以目的蛋白與β-actin條帶A值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6細(xì)胞凋亡檢測

1.6.1 TUNEL法 收集Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染72 h組、無關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染試劑組和未轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞，制備細(xì)胞爬片， 滴加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃避光孵育1 h；滴加Converter-POD 50 μL，37 ℃避光孵育；DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，蘇木素復(fù)染。于高倍鏡(×400)下選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)，求平均數(shù)。凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/200)×100%。

1.6.2 流式細(xì)胞術(shù)法 收集Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染72 h組、無關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染試劑組和未轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞(保證細(xì)胞密度>1×106mL-1)。PBS洗滌3遍，用100 μL預(yù)冷的Binding緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V和5 μL PI混勻避光孵育15 min，再加入400 μL Binding緩沖液混勻后，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間Smo、bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平及AI、凋亡細(xì)胞比例的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 6組細(xì)胞中Smo及bcl-2mRNA的表達(dá)見圖1和表2?？梢钥闯?，Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染后細(xì)胞Smo和bcl-2 mRNA表達(dá)水平均較對照降低，以轉(zhuǎn)染72 h降低最顯著。

圖1 6組細(xì)胞中Smo及bcl-2 mRNA的表達(dá)

M：DNA Marker；1：未轉(zhuǎn)染對照組；2：轉(zhuǎn)染試劑組；3：無關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染組；4～6：Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染24、48、72 h組。

表2 6組細(xì)胞中Smo及bcl-2 mRNA的表達(dá)

*:與未轉(zhuǎn)染對照組、轉(zhuǎn)染試劑組和無關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染組相比，P<0.05；Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染組間兩兩比較，P<0.05。

2.2 4組細(xì)胞中Smo及bcl-2蛋白的表達(dá)見圖2和表3。可以看出，Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞Smo和bcl-2蛋白表達(dá)水平較對照明顯降低。

1：未轉(zhuǎn)染對照組；2：轉(zhuǎn)染試劑組；3：無關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染組；4：Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染72 h組。

表3 4組細(xì)胞中Smo和bcl-2蛋白的表達(dá)

*:與未轉(zhuǎn)染對照組、轉(zhuǎn)染試劑組和無關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染組相比，P<0.05。

2.3 4組細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果見圖3和表4。Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染72 h組AI、流式細(xì)胞術(shù)測得的晚期凋亡細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞比例均明顯大于其他3組。

圖3 細(xì)胞凋亡TUNEL法染色圖(×400)

表4 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 %

*:與未轉(zhuǎn)染對照組、轉(zhuǎn)染試劑組和無關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染組相比，P<0.05。

3 討論

近年來的研究[2-7]表明，多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與Hh信號通路的異常激活及過表達(dá)有著密切的關(guān)系，如肺小細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、膀胱癌、胰腺癌、髓母細(xì)胞瘤、肝癌、前列腺癌、胃癌、乳癌等。通過抑制Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵基因進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為研究熱點(diǎn)。

Smo基因是一個(gè)原癌基因，位于染色體7q31-7q32，編碼一個(gè)含有1 024個(gè)氨基酸的蛋白。Smo蛋白有3個(gè)區(qū)域：細(xì)胞內(nèi)羧基端區(qū)域、細(xì)胞外氨基端區(qū)域和疏水跨膜區(qū)[8]。當(dāng)Hh蛋白不存在時(shí)，受體蛋白Ptch抑制Smo蛋白的活性，進(jìn)而阻斷Hh信號通路[9]。當(dāng)Hh蛋白存在時(shí)，Hh蛋白與Ptch蛋白結(jié)合，解除了對Smo蛋白的抑制，激活的Smo 蛋白可以把細(xì)胞外的Hh信號轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的Gli信號，進(jìn)而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，包括Hhip、ptch、Gli1、cyclinD、Bmi1、bcl-2等[10]。相關(guān)研究[11-15]表明，采用siRNA抑制胃癌MGC803細(xì)胞、乳癌MCF-7細(xì)胞、肝癌Huh-7細(xì)胞、胰腺癌PANC-1細(xì)胞中Smo和Gli1的表達(dá)，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，表明Smo可能是腫瘤基因治療的有效靶點(diǎn)。

前期研究結(jié)果表明[16-17]，Smo在人食管鱗狀細(xì)胞癌及裸鼠食管癌移植瘤組織中高表達(dá)；Smo siRNA可通過下調(diào)癌細(xì)胞中Smo 基因的表達(dá), 誘導(dǎo)裸鼠食管癌移植瘤細(xì)胞的凋亡。該研究中作者設(shè)計(jì)合成了Smo siRNA-3，其可在蛋白和mRNA水平上有效抑制EC9706細(xì)胞中Smo和bcl-2的表達(dá)；TUNEL法及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，Smo siRNA-3轉(zhuǎn)染72 h后，EC9706細(xì)胞凋亡明顯增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，沉默Smo基因表達(dá)可以促進(jìn)EC9706細(xì)胞的凋亡，該作用可能由bcl-2介導(dǎo)。

綜上所述，Smo siRNA沉默Smo基因表達(dá)，可通過下調(diào)EC9706細(xì)胞中bcl-2的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Smo有望成為食管癌基因治療的靶點(diǎn)。

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(2013-08-08收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Influence of Smo siRNA on apoptosis,Smo and bcl-2 genes expression in EC9706 cells

GUOAiye1)，DINGYanzhi2)，ZHANGHu3)，ZHANGHongxin3)，CHENKuisheng3)

1)ClinicalLaboratory,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003 2)DepartmentofPathology，HenanCancerHospital,Zhengzhou450003 3)DepartmentofPathology，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity;HenanKeyLaboratoryofTumorPathology,Zhengzhou450052

Smo;bcl-2;esophageal carcinoma;apoptosis

Aim: To investigate the influence of Smo siRNA on bcl-2 expression and apoptosis of human esophgeal carcinoma EC9706 cells.Methods: Smo siRNA-3 was designed and synthesized successfully,and then transfected into EC9706 cells.The expression of Smo,bcl-2 protein and mRNA of transfected EC9706 cells were detected by Western blot and RT-PCR,respectively,the apoptosis were detected by TUNEL method and flow cytometry,and apoptosis index(AI) and apoptosis cells proportion were calculated.The cells without transfection,transfected with unrelated sequence siRNA or reagent were the control.Results: Compared with the control groups, the mRNA expressions of Smo and bcl-2 in cells transfected with Smo siRNA-3 for 24, 48 and 72 h decreased(P<0.05),especially in cells transfected for 72 h(P<0.05).Compared with the control groups,the protein expressions of Smo and bcl-2 in cells transfected with Smo siRNA-3 for 72 h decreased(F=151.310,143.190，P<0.001),AI increased(F=66.270，P<0.001),and apoptosis cells proportion was higher(P<0.05).Conclusion: Smo siRNA may decrease the expression of bcl-2 through silencing the Smo expression,thus promote the apoptosis of EC9706 cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.001

*河南省科技創(chuàng)新杰出人才基金資助項(xiàng)目 114200510007

R735.1