趙志華，陳可欣

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 天津 300060

乳癌組織中Pax1的表達(dá)及其對(duì)乳癌MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

趙志華，陳可欣#

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 天津 300060

#通訊作者，女，1963年11月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤臨床，E-mail：sunjingyan126@126.com

乳癌；配對(duì)盒家族基因1；MDA-MB-231 細(xì)胞

目的：研究Pax1在乳癌組織中的表達(dá)及其對(duì)乳癌MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法采用Western blot檢測(cè)200乳腺原發(fā)癌和癌旁組織中Pax1蛋白的表達(dá)。采用化學(xué)合成針對(duì)Pax1基因的兩個(gè)小干擾RNA(siRNA- Pax1-1和siRNA- Pax1-2)下調(diào)該基因的表達(dá)，應(yīng)用MTT和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果Pax1在乳腺原發(fā)癌組織中的表達(dá)低于相應(yīng)的癌旁組織，沉默Pax1表達(dá)可促進(jìn)乳癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲(F=52.413和72.741，P<0.001)。結(jié)論P(yáng)ax1有望成為乳癌早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的生物分子標(biāo)志物。

乳癌是女性最常罹患的惡性腫瘤[1]，其本質(zhì)是一種多基因異常疾病，通過原癌基因的過表達(dá)，同時(shí)伴隨抑癌基因的突變?nèi)笔?，從而使腫瘤細(xì)胞逃避了正常生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制[2]。從根本上糾正與乳癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因異常的基因治療已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[3]。Lai等[4]首次研究發(fā)現(xiàn)，配對(duì)盒家族基因1(paired boxed gene 1，Pax1)基因在宮頸癌中出現(xiàn)異常甲基化，甲基化異常頻率可達(dá)94.5%，提示Pax1在宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)中具有重要作用。但目前對(duì)于Pax1在乳癌發(fā)生發(fā)展中的研究目前尚未見報(bào)道。作者檢測(cè)Pax1蛋白在乳癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本的表達(dá)情況，觀察沉默Pax1基因表達(dá)對(duì)乳癌MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)的影響，以期為深入研究乳癌細(xì)胞的分子病理機(jī)制提供新線索和策略。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源200例乳腺原發(fā)癌及其癌旁正常組織標(biāo)本取自2004年9月至2010年1月天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的乳癌患者，所有患者術(shù)前均未行放療和化療。組織樣本經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存。所有樣本采集和使用均征得患者同意并簽署知情同意書，并由天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)同意使用。

1.2Pax1蛋白的檢測(cè)采用Western blot法。40 μg總蛋白經(jīng)80 V電壓電泳3 h后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜。TBS-T(pH 8.3)液室溫封閉1 h后加入兔抗人Pax1一抗(英國(guó)Abcam公司)，4 ℃平搖過夜，TBS-T洗膜6次后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜6次， 加ECL (美國(guó)GE Healthcare 公司)，顯色1～2 min。用ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)照相分析。

1.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組和處理 MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL 青霉素和 100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。接種2×105個(gè)細(xì)胞/孔于6孔板，以無(wú)抗生素的含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)為4組?？瞻讓?duì)照組：無(wú)處理的MDA-MB-231細(xì)胞；轉(zhuǎn)染對(duì)照組：轉(zhuǎn)染si-control；轉(zhuǎn)染1組：轉(zhuǎn)染siRNA-Pax1-1；轉(zhuǎn)染2組：轉(zhuǎn)染siRNA-Pax1-2。si-control、siRNA-Pax1-1和siRNA-Pax1-2均由上海吉瑪公司合成，轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。100 nmol/L siRNA-PAX1-1、siRNA-PAX1-2 分別與2 μL Lipofectamine 2000各溶于50 μL培養(yǎng)基，孵育5 min后混合20 min，緩慢滴入置于500 μL OPTI-DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞中，6 h后將培養(yǎng)液更換為含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT法。4組細(xì)胞分別處理48 h后，胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至 1 000～10 000/孔。體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37 ℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，設(shè)3個(gè)復(fù)孔,于 24、48、72 h后每孔加入10 mL 5 g/L MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心用PBS沖2～3遍后。每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)570 nm處測(cè)量各孔的吸光光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[5]。

1.3.3 細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。每組均將懸浮于500 μL無(wú)血清培養(yǎng)基的5×104個(gè)細(xì)胞分別接種于含和不含Matrigel的Transwell上室，下層加入750 μL含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)8 h。取出Transwell小室，用棉簽拭去上層未穿過的細(xì)胞，蘇木素染色后封片，于鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)目。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0分析。各組細(xì)胞增殖抑制率和穿膜細(xì)胞數(shù)目的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1乳癌組織和癌旁正常乳腺組織中Pax1的表達(dá)乳癌組織中Pax1蛋白的表達(dá)低于癌旁正常乳腺組織(圖1)。

2.2 4組細(xì)胞Pax1蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)染1組和2組中Pax1表達(dá)水平較對(duì)照組降低，見圖2。

圖1 2種組織中Pax1蛋白的表達(dá)

圖2 轉(zhuǎn)染效率鑒定

1：空白對(duì)照組；2：轉(zhuǎn)染對(duì)照組；3：轉(zhuǎn)染1組；4： 轉(zhuǎn)染2組。

2.3沉默Pax1對(duì)乳癌細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響見表1。

表1 4組細(xì)胞中細(xì)胞增殖和穿膜細(xì)胞數(shù)目的比較

*:與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與轉(zhuǎn)染1組比較，P<0.05。

3 討論

Pax1基因位于20p11.2，分布于細(xì)胞核。Pax基因家族分為4類：1類和3類在維護(hù)組織特異干細(xì)胞中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤的發(fā)展中過表達(dá)；1類和4類包括Paxl、Pax4、Pax6和Pax9，在惡性腫瘤中常表達(dá)受抑。文獻(xiàn)[6]報(bào)道，乳癌早期組織中Pax6啟動(dòng)子高甲基化且低表達(dá)，Hus等[7]研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中Pax9低表達(dá)，且Pax9高表達(dá)患者具有良好的預(yù)后。Hata等[8]發(fā)現(xiàn)，Pax6對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抑制功能，而Pax4則對(duì)人類黑色素瘤具有抑制作用，Pax基因家族在不同腫瘤中發(fā)揮著不同的作用，與腫瘤的良惡性相關(guān)，因此抑制Pax可以成為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。研究[5]報(bào)道Pax1參與骨骼發(fā)育、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控轉(zhuǎn)錄，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是抑癌基因，其啟動(dòng)CpG島甲基化是其在表觀遺傳學(xué)上的重要調(diào)節(jié)方式，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

該研究發(fā)現(xiàn)乳癌組織中Pax1蛋白的表達(dá)下降，提示Pax1在乳癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。作者將針對(duì)Pax1的siRNA轉(zhuǎn)染乳癌細(xì)胞系MDA-MB-231，檢測(cè)到較轉(zhuǎn)染非特異性siRNA的細(xì)胞Pax1蛋白表達(dá)減少，說明轉(zhuǎn)染有效。 MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低表達(dá)Pax1的乳癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力明顯提高；Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低表達(dá)Pax1的乳癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。

該研究使用針對(duì)Pax1的siRNA沉默該基因表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞在增殖、遷移和侵襲方面的影響，提示Paxl在乳癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮潛在的抑癌基因作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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(2013-12-04收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Expression of Pax1 in breast cancer tissue and influence on proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 cells

ZHAOZhihua,CHENKexin

CancerHospital,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300060

breast cancer;paired boxed gene 1;MDA-MB-231 cell

Aim: To investigate the expression of paired boxed gene 1 (Pax1) gene in breast cancer tissue and to explore the influence on proliferation status, migration ability and metastatic ability of breast cancer cells MDA-MB-231．Methods: Western blot were used to examine the expression of Pax1 in samps, including 200 normal tissues and 200 primary tumors. MTT and transwell were used to analyze the ability of proliferation, migration, and invasion in Pax1 siRNA-transfected MDA-MB-231 cells. Results: The expression of Pax1 was lower in breast cancer tissues than other tissues. Furthermore, knockdown of Pax1 expression resulted in increased proliferation and invasion in MDA-MB-231 cells in vitro(F=52.413 and 72.741，P<0.001). Conclusion: The expression of Pax1 gene shows and obvious downgraded in breast cancer tissue.Low expression of Pax1 gene can increase apeptosis and proliteration of MDA-MB-231 cells, which may provide a strategy for blocking breast cancer and progression.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.022

R737.9