盧久富,白躍飛,周 鵬,姜 敏,岳思羽,糜桑桑,張 旭,洪曉菲，關旭久

(1.陜西理工學院 化學學院，陜西 漢中 723001；2.東北制藥集團股份有限公司，遼寧 沈陽 110027；3.東北制藥(沈陽)施德藥業(yè)有限公司，遼寧 沈陽 110026)

·研究論文·

新型吡唑甲酰胺類化合物的合成及其抗腫瘤活性*

盧久富1,白躍飛2,周 鵬3,姜 敏1,岳思羽1,糜桑桑3,張 旭3,洪曉菲3，關旭久3

(1.陜西理工學院 化學學院，陜西 漢中 723001；2.東北制藥集團股份有限公司，遼寧 沈陽 110027；3.東北制藥(沈陽)施德藥業(yè)有限公司，遼寧 沈陽 110026)

以2-氰基乙酰胺為起始原料，與三乙氧基取代化合物經加成反應制得取代烯酰胺類化合物(3a～3c);3a～3c與芳肼經環(huán)合反應得取代吡唑-4-甲酰胺類化合物(5a～5d);5a～5d與酰氯經酰化反應合成了6個新型的1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4-吡唑甲酰胺類化合物(7a～7f)，其結構經1H NMR,MS和元素分析表征。抗腫瘤活性測試結果表明，7a～7f對人乳腺癌細胞(A)、人宮頸癌細胞(B)和人肝癌細胞(C)有一定抑制作用，其中3-甲基-5-[4-(甲磺酰胺基)苯甲酰胺]-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺(7f)的抑制活性最好，對A,B和C的IC50分別為3.25μM，8.74μM和10.47μM。

2-氰基乙酰胺;吡唑甲酰胺；合成；抗腫瘤活性

臨床上應用的抗腫瘤藥物種類繁多，其中化療藥物主要有烷化劑鉑絡合物抗腫瘤藥物、蔥環(huán)類抗腫瘤藥物、破壞DNA的抗生素等[1-2]。天然抗腫瘤藥物的研究也占有相當大的比例，如目前臨床上常用一些藥物有喜樹堿、長春新堿、紫杉醇等。然而，現有的抗腫瘤藥物存在著選擇性較差、毒副作用、耐藥性等問題[3-4]。尋找高效低毒的抗腫瘤藥物仍是科學家面臨的重要課題。

本文以2-氰基乙酰胺(1)為起始原料，與三乙氧基取代化合物(2a～2c)經加成反應制得取代烯酰胺類化合物(3a～3c);3a～3c與芳肼(4a,4d)經環(huán)合反應制得取代吡唑-4-甲酰胺類化合物(5a～5d);5a～5f與酰氯(6a,6c～6f)經酰化反應合成了6個新型的1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4-吡唑甲酰胺類化合物(7a～7f)，其結構經1H NMR,MS和元素分析表征。并研究了7a～7f對人乳腺癌細胞、人宮頸癌細胞和人肝癌細胞的抗腫瘤活性。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

ARX-300型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；Shimadzu GC-MS2010型氣質聯(lián)用儀(GC/EI-MS)。

薄層層析用硅膠GF254，青島海洋化工廠；柱層析用硅膠，試劑級，160目～200目，安徽良臣硅源材料有限公司；1,泰興市沃特爾化工廠；乙酸酐，東北制藥集團股份有限公司；其余所用試劑均為分析純，國藥集團沈陽化學試劑公司。

1．2 合成

(1)3a～3c的合成(以3a為例)

在反應瓶中依次加入13.36g(39.96mmol)和乙酸酐7mL，攪拌使其溶解；加入1,1,1-三乙氧基乙烷(2a)7.13g(43.95mmol)，于100℃反應過夜。冷卻至室溫，加入乙醚15mL，過濾，濾餅干燥得白色固體2-氰基-3-乙氧丁基-2-烯胺(3a)3.3g，收率54%，m.p.95℃～97℃；EI-MSm/z: 155.2{[M+H]+}。

用類似方法合成3b～3c。

2-氰基-3-乙氧基-3-甲氧基丙酰胺(3b): 白色粉末，收率61.3%,m.p.81℃～83℃；EI-MSm/z: 171.2{[M+H]+}。

2-氰基-3-乙氧基-3-氟丙酰胺(3c): 類白色粉末，收率57.6%,m.p.94℃～96℃；EI-MSm/z: 159.2{[M+H]+}。

(2)5a～5d的合成(以5a為例)

在反應瓶中依次3a1.0g(6.49mmol)和甲醇15mL，攪拌使其溶解；加入4-氟苯肼(4a)840mg(7.77mmol)，于80℃反應過夜。減壓濃縮后經硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶1]純化得黃色固體5-氨基-1-(4-氟苯基)-3-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(5a)1.0g，收率71%，m.p.92℃～94℃；EI-MSm/z: 217.2{[M+H]+}。

酵母菌：“什么糖我們都喜歡吃。但我說的糖是指糖類，有葡萄糖、果糖、麥芽糖等，還有一些名稱里不帶‘糖’字的糖，如淀粉等。怎么樣，我們愛好廣泛吧！”

用類似方法合成5b～5d。

5-氨基-1-(4-氟苯基)-3-甲氧基-1H-吡唑-4-甲酰胺(5b): 白色固體，收率68.5%,m.p.91℃～93℃；EI-MSm/z: 251.2{[M+H]+}。

5-氨基-1-(4-氟苯基)-3-氟-1H-吡唑-4-甲酰胺(5c): 白色固體，收率59.2%,m.p.87℃～89℃；EI-MSm/z: 239.2{[M+H]+}。

5-氨基-1-苯基-3-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(5d): 白色固體，收率59.2%,m.p.99℃～101℃；EI-MSm/z: 217.2{[M+H]+}。

(3)7a～7f的合成(以7a為例)

在反應瓶中依次加入5a546mg(2.53mmol)和THF 40mL,攪拌使其溶解；加入1-(嘧啶基-4)哌啶-4-酰氯(6a)1.5g(6.70mmol)和叔丁醇鉀848mg(7.57mmol)，于室溫反應2h。減壓濃縮后經硅膠柱層析[洗脫劑：V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1]純化得棕色固體N-(4-氨甲?；?3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5)-1-(嘧啶-4)哌啶-4-咪唑羧基酰胺(7a)0.46g。

7a：收率47%，m.p.115℃～117℃;1H NMRδ：1.30(s,2H),1.64～1.68(m,2H),1.93～1.97(m,2H),2.46(s,3H),2.89(brs,1H),4.15(d,2H),7.10～7.12(m,2H),7.45～7.52(m,5H),8.10～8.13(m,2H)；EI-MSm/z: 405.2{[M+H]+}。

N-[4-甲?；?1-(4-氟苯基)-3-甲氧基-1H-吡唑-5)-1-(吡啶-4)-哌啶-4-甲酰胺(7b)：收率32%，m.p.101℃～103℃;1H NMRδ：1.30(s,2H),1.64～1.68(m,2H),1.93～1.97(m,2H),2.46(s,3H),2.89(brs,1H),4.02(s,3H),4.15(d,2H),7.10～7.12(m,2H),7.45～7.52(m,4H),8.10～8.13(m,2H)；EI-MSm/z: 439.2{[M+H]+}。

5-苯甲?；?3-氟-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(7c)：收率44%，m.p.144℃～146℃；EI-MSm/z: 343.2{[M+H]+}；Anal.calcd for C17H12N4O2F2: C 59.65,H 3.53,N 16.37；found C 59.60,H 3.51,N 16.30。

1-(氮雜環(huán)丁烷-3)-N-(4-羰基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5)哌啶-4-甲酰胺(7d)：收率39%，m.p.121℃～123℃;1H NMRδ：1.88～2.05(m,4H),2.48(s,3H),2.63～2.69(m,1H),2.80(t,2H),3.20～3.30(m,2H),4.06～4.12(m,1H),4.26～4.45(m,4H),7.42～7.56(m,5H)；EI-MSm/z: 383.2{[M+H]+}。

N-[4-甲?；?1-(4-氟苯基)-3-甲氧基-1H-吡唑-5)-1-甲基哌啶-4-甲酰胺(7e)：收率45%，m.p.122℃～124℃;1H NMRδ：1.62～1.65(m,4H),1.98～2.01(m,4H),2.46(s,3H),2.87(brs,1H),4.00(s,3H),4.15(d,2H),7.35～7.52(m,4H)；EI-MSm/z: 685{[M+H]+}。

5-苯甲?；?3-氟-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(7f)：收率42%，m.p.126℃～128℃;1H NMRδ：2.51(s,3H),3.00(s,3H),7.43～7.51(m,7H),7.56(brs,1H),7.71(s,1H)；EI-MSm/z: 414.2{[M+H]+}。

1．3 抗腫瘤活性測試

采用MTT 法測定7a～7f對人乳腺癌細胞、人宮頸癌細胞和人肝癌細胞的抑制活性，用半數抑制濃度(IC50)表示[3-4]。

以人乳腺癌細胞為例：取0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的MCF-7細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔200μL(含3×104～5×104個細胞)。將培養(yǎng)板放入CO2孵箱，于37℃,5%CO2條件下，待培養(yǎng)細胞貼壁后加入不同濃度的待測化合物，每個化合物測試4個濃度[(1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8)mol·L-1]，對照組加入與給藥組等體積的溶劑。在CO2孵箱中于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)72h。每孔加入20μL MTT 溶液(5mg·mL-1)，于37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，棄去孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入150μL DMSO，輕度振蕩10min，選擇570nm 波長，用酶標儀測定各孔光吸收值(OD值)，重復測試3次，取平均值，用下式計算化合物對腫瘤細胞的抑制率，并計算IC50。

2 結果與討論

2.1 合成

在合成中間體5a～5d時，需嚴格控制反應溫度，如內溫超過90℃，TLC顯示產生的雜質點異常多，給產品的分離提純帶來極大不便；如內溫低于75℃，反應48h后，TLC顯示仍有大量原料未反應完全。較佳反應溫度為80℃。

2.2 抗腫瘤活性

7a～7f對人乳腺癌細胞、人宮頸癌細胞和人肝癌細胞的抑制活性數據見表1。由表1可見，7f對三種腫瘤細胞顯示了最低的抑制濃度；7c稍次之；7a,7b和7d抑制活性較差。由此可以初步判斷，當R1為小分子取代基時，Ar和R2分別為小分子苯基和4-氨基取代苯基或4-氟苯基和苯基時有利于提高化合物的抗腫瘤活性。

3 結論

以2-氰基乙酰胺為起始原料，合成了6個1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4-吡唑甲酰胺類化合物(7a～7f)。藥理活性篩選結果顯示，3-甲基-5-[4-(甲磺酰胺基)苯甲酰胺]-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺(7f)對人乳腺癌細胞、人宮頸癌細胞和人肝癌細胞的抑制活性最好，其IC50分別為3.25μM，8.74μM和10.47μM，具有良好的抗腫瘤方面開發(fā)應用前景。

表1 7a～7f的抗腫瘤活性*Table1 Antitumor activities of 7a～7f

*MCF-7:人乳腺癌細胞,HeLa:人宮頸癌細胞,BeL7402:人肝癌細胞

[1] 立彥,王自正.pgP介導的腫瘤多藥耐藥逆轉研究進展[J].放射免疫學雜志,2005，18(2):133-134.

[2] 立彥,王自正.化學類抗腫瘤藥物的研究進展[J].放射免疫學雜志,2010，41(7):8-11.

[3] 盧久富.1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4-吡唑甲酰胺類化合物及其應用[P].CN 102558058,2012.

[4] R Y Chen,J Wu.Synthesis and biological activity of 1-alkyl(or aryl)-5-substituted amino-4-(N-alkylcarbamoyl)pyrazole[J].Gaodeng Xuexiao Huaxue Xuebao,1993,13(1):52-55.

[5] Goldfarb DS.Method using lifespan-altering compounds for altering the lifespan of eukaryotic organisms,and screening for such compounds[P].US 20090163545,2009.

[6] Quan ML,Lam PY,Li Yl,etal.Preparation of arylamides and heterocyclylamides as factor Xa inhibitors for treatment of thromboembolic disorders[P].WO 2002000651,2002.

SynthesisandAntitumorActivitiesofNovelPyrazolecarboxamideDerivatives

LU Jiu-fu1，BAI Yue-fei2，ZHOU Peng3，JIANG Min1, YUE Si-yu1, MI Sang-sang3，ZHANG Xu3，HONG Xiao-fei3, GUAN Xu-jiu3

(1.School of Chemistry,Shanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China;2.Northeast Pharmaceutical Group Co.,Ltd,Shenyang 110027,China;3.Northeast Pharmaceutical Group Shi De Pharmaceutical Co.,Ltd,Shen Yang 110026,China)

Three substituted enamide compounds(3a～3c)were prepared by addition reaction of 2-cyanoacetamide with the triethoxyl substituted compounds.Four substituted pyrazole-4-carboxamides(5a～5d)were prepared by cyclization of3a～3cwith phenylhydrazine.Six novel pyrazolecarboxamide derivatives(7a～7f)were synthesized by acylation of5a～5fwith acyl chloride.The structures were characterized by1H NMR,MS and elemental analysis.Antitumor activities were tested against MCF-7(A),Hela(B)and BeL7402(C)cancer cells.The results showed that7a～7fexhibit good inhibitory activity.IC50of 3-Methyl-5-[4-(methylsulfonamido)benzamido]-1-phenyl-1H-pyrazole-4-carboxamide(7f)against A,B and C were 3.25μM，8.74μM and 10.47μM,respectively.

2-cyanoacetamide;pyrazolecarboxamide;synthesis;antitumor activity

2013-06-25;

2014-06-09

陜西省教育廳科學研究項目(12JK0637);陜西理工學院科研計劃自組項目(SLGKY12-11)

盧久富(1981-)，男，漢族，遼寧海城人，講師，主要從事藥物合成研究。E-mail: jiufulu@163.com

O626.2；O621.3

A

1005-1511(2014)05-0612-04