張哲 王超

·論著·

過表達(dá)KLF4對(duì)棕櫚酸所致L6骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗的影響

張哲 王超

目的 探討Krüppel樣因子4 (KLF4)過表達(dá)對(duì)大鼠L6骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗的影響。方法采用棕櫚酸誘導(dǎo)法建立大鼠L6骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗模型，隨機(jī)分為對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組。對(duì)照組轉(zhuǎn)染腺病毒空載體(Ad)，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染KLF4腺病毒表達(dá)載體(Ad-KLF4)。采用Real-time PCR和Western-blot檢測(cè)兩組KLF4、胰島素受體(IR)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)的表達(dá)水平，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)兩組培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度。結(jié)果與對(duì)照組比較，棕櫚酸誘導(dǎo)組對(duì)葡萄糖的攝取量顯著降低(P<0.05)，KLF4、IR、GLUT4表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。KLF4過表達(dá)可顯著提高細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，并上調(diào)IR、GLUT4表達(dá)。結(jié)論過表達(dá)KLF4可導(dǎo)致IR、GLUT4表達(dá)上調(diào)，并改善骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗。

Krüppel樣因子4;基因轉(zhuǎn)染;骨骼肌細(xì)胞;胰島素抵抗

胰島素抵抗是機(jī)體靶組織(骨骼肌、肝臟、脂肪)對(duì)胰島素敏感性降低的一種病理狀態(tài)，長(zhǎng)期胰島素抵抗與糖尿病、肥胖及高血壓等心血管疾病的發(fā)病密切相關(guān)，而骨骼肌是胰島素刺激下機(jī)體攝取并利用葡萄糖的主要靶器官[1]。Krüppel樣因子4 (Krüppel-like factor 4，KLF4)是一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、分化、血管形成、腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用[2]。Aktug等[3]采用免疫組織化學(xué)方法證實(shí)，KLF4在STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠睪丸組織表達(dá)下調(diào)，提示KLF4與糖尿病的病理過程有關(guān)。然而，KLF4在骨骼肌胰島素抵抗中的作用目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用L6骨骼肌細(xì)胞株，通過棕櫚酸誘導(dǎo)造成胰島素抵抗模型，旨在觀察KLF4過表達(dá)對(duì)胰島素抵抗的影響，為研究胰島素抵抗的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 L6細(xì)胞株(中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心)；α-MEM、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶(美國(guó)GIBCO公司)；葡萄糖氧化酶試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；多克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)。Lipofectamin 2000、RT-PCR相關(guān)試劑(美國(guó)Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、胰島素抵抗模型的建立和鑒定5% CO2、37℃飽和濕度條件下,將復(fù)蘇后的大鼠L6肌細(xì)胞接種在含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2 d后更換含2% FBS的α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每天換液1次，直至細(xì)胞長(zhǎng)出肌管。細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)入24孔板(1×106個(gè)/孔)，隨機(jī)分為對(duì)照組和誘導(dǎo)組。對(duì)照組加入正常α-MEM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含0.3 mmol/L棕櫚酸的α-MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。兩組細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌2次，先加入含100 ng/ml胰島素的正常培養(yǎng)基孵育30 min，再加入5.6 mmol/L葡萄糖孵育24 h。采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定細(xì)胞上清液中葡萄糖濃度。

1.2.2 重組腺病毒轉(zhuǎn)染將大鼠全長(zhǎng)KLF4 cDNA序列克隆到腺病毒表達(dá)載體pAd/CMV/V5-DEST中。酶切和測(cè)序鑒定后，將空載體病毒及重組腺病毒利用Lipofectamin 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A293細(xì)胞，包裝、擴(kuò)增后得到重組腺病毒質(zhì)粒Ad-KLF4。轉(zhuǎn)染24 h后反復(fù)凍融裂解細(xì)胞收集上清液，G418篩選陽性克隆并培養(yǎng)14 d。誘導(dǎo)組細(xì)胞隨機(jī)分為空載體對(duì)照組(Ad)和轉(zhuǎn)染組(Ad-KLF4)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于病毒感染。

1.2.3 Real-time PCR：根據(jù)GeneBank中大鼠KLF4、IR、GLUT4 mRNA序列，采用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Trizol提取各組細(xì)胞總RNA,用紫外分光光度計(jì)鑒定RNA的純度并定量。參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA第1鏈。PCR 反應(yīng)采用ABI 7300型熒光定量PCR儀。目的基因相對(duì)表達(dá)量RQ =2-△△Ct，設(shè)GAPDH為內(nèi)參照基因。

表1 KLF4、IR、GLUT4、GAPDH引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.4 Western-blot各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品按4∶1體積比加入5×上樣緩沖液內(nèi)混勻，100℃煮沸5 min變性。將100 μg總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，10%脫脂奶粉封閉2 h。用特異性一抗(1∶2 000) 4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h,洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件分析，檢測(cè)蛋白條帶IOD值。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和誘導(dǎo)組葡萄糖代謝水平的比較 葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞上清液中葡萄糖濃度(13.09±2.52)mmol/L與對(duì)照組(3.74±0.12)mmol/L比較顯著增加(P<0.05)，提示棕櫚酸誘導(dǎo)L6肌細(xì)胞IR模型建立成功。

2.2 對(duì)照組和誘導(dǎo)組KLF4、IR、GLUT4表達(dá)的比較 以GAPDH為內(nèi)參照，Real-time PCR和Western-blot結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組KLF4/GAPDH、IR/GAPDH、GLUT4/GAPDH mRNA相對(duì)表達(dá)水平與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖1。

組別KLF4/GAPDHmRNA相對(duì)表達(dá)水平IR/GAPDHmRNA相對(duì)表達(dá)水平GLUT4/GAPDHmRNA相對(duì)表達(dá)水平對(duì)照組0．81±0．330．88±0．360．75±0．28誘導(dǎo)組0．32±0．08?0．47±0．16?0．42±0．11?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1 棕櫚酸刺激對(duì)KLF4、IR、GLU4蛋白表達(dá)的影響

2.3 Ad-KLF4轉(zhuǎn)染L6肌細(xì)胞對(duì)IR、GLUT4表達(dá)和葡萄糖代謝的影響 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染L6肌細(xì)胞48 h后， Ad-KLF4組 KLF4/GAPDH mRNA、IR/GAPDH mRNA和GLUT4/GAPDH相對(duì)表達(dá)水平與Ad組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的代謝能力亦明顯改善，Ad-KLF4組細(xì)胞上清液中葡萄糖濃度(7.6±1.3)mmol/L與空載體對(duì)照組(13.2±2.7)mmol/L比較顯著降低(P<0.05)。見表3，圖2。

組別KLF4/GAPDHmRNA相對(duì)表達(dá)水平IR/GAPDHmRNA相對(duì)表達(dá)水平GLUT4/GAPDHmRNA相對(duì)表達(dá)水平Ad組0．30±0．060．43±0．130．39±0．08Ad?KLF4組0．72±0．31?0．65±0．24?0．62±0．18?

注：與Ad組比較，*P<0.05

3 討論

胰島素抵抗是周圍組織對(duì)胰島素敏感性降低，胰島素刺激下葡萄糖的利用率下降，導(dǎo)致糖脂代謝紊亂的一種病理狀態(tài)。胰島素抵抗形成機(jī)制的研究對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療具有重要意義。而體內(nèi)葡萄糖主要被骨骼肌組織攝取和利用，骨骼肌對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙是Ⅱ型糖尿病胰島素抵抗的重要原因。

圖2 過表達(dá)KLF4對(duì)IR、GLUT4蛋白表達(dá)和葡萄糖代謝水平的影響

KLF4是一種具有結(jié)合位點(diǎn)特異性的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，其羧基端含有3個(gè)連續(xù)且高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)(CX2-4CX3FX5LX2HX3H)，此為該家族的典型結(jié)構(gòu)特征。KLF4通過與p53、細(xì)胞周期蛋白D1等下游基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合元件結(jié)合調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用。迄今研究發(fā)現(xiàn)，KLF4與腫瘤發(fā)生、皮膚屏障形成、睪丸發(fā)育等生理、病理過程密切相關(guān)[4]。

2013年，Aktug等[3]研究提出在Ⅰ型糖尿病大鼠睪丸組織石蠟切片中KLF4表達(dá)水平明顯降低，提示KLF4參與了糖尿病的病理過程。然而，KLF4對(duì)骨骼肌胰島素抵抗的影響目前尚未見報(bào)道。為了闡明KLF4在骨骼肌胰島素抵抗中的作用，我們建立了L6骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗模型。Real-time PCR和Western-blot方法證實(shí)，誘導(dǎo)組細(xì)胞KLF4、IR、GLUT4表達(dá)顯著下調(diào)，且細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量顯著降低。進(jìn)而，

我們利用腺病毒表達(dá)載體將外源KLF4基因成功導(dǎo)入L6細(xì)胞，使之在細(xì)胞中高效表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KLF4可明顯上調(diào)IR、GLUT4的表達(dá)并改善骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗，提示 KLF4參與了骨骼肌胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。

目前，KLF4在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明。多項(xiàng)研究表明，KLF4和p300相互作用造成KLF4乙?；笸ㄟ^增強(qiáng)腸堿性磷酸酶、p21、Mfn2啟動(dòng)子活性促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[5,6]。在骨骼肌細(xì)胞，KLF4是否通過上述機(jī)制調(diào)控胰島素抵抗過程還有待于進(jìn)一步研究?？傊?，本研究首次提出KLF4對(duì)骨骼肌胰島素抵抗產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控作用，KLF4可能通過上調(diào)IR、GLUT4的表達(dá)減輕骨骼肌胰島素抵抗。研究KLF4在骨骼肌胰島素抵抗中的作用有助于闡明疾病發(fā)生的分子機(jī)制，從而對(duì)疾病的防治提供潛在的治療靶點(diǎn)。

1 Lipina C,Macrae K,Suhm T,et al.Mitochondrial substrate availability and its role in lipid-induced insulin resistance and proinflammatorysignalingin skeletal muscle.Diabetes,2013，62：3426-3436.

2 Lin ZS,Chu HC,Yen YC,et al.Krüppel-like factor 4,a tumor suppressor in hepatocellular carcinoma cells reverts epithelial mesenchymal transition by suppressing slug expression.PLoS One,2012,7：43593.

3 Aktug H,Uysal A,Yavasoglu A,et al.The detrimental effects ofdiabeteson pluripotency determined byKLF4,SOX2,C-MYC and OCT4 immunoreactivity in rat testes.Adv Clin Exp Med,2013,22:327-335.

4 Evans PM,Liu C.Roles of Krüpel-like factor 4 in normal homeostasis,cancer and stem cells.ActaBiochimBiophys Sin,2008,40:554-564.

5 Rui ZH,Mei HA,Bin ZH,et al.Krüppel-like factor 4 interacts with p300 to activate mitofusin 2 gene expression induced by all-transretinoic acid in VSMCs.ActaPharmacologica Sinica,2010,31:1293-1302.

6 Evans PM,Zhang W,Chen X,et al.Krüppel-like factor 4 is acetylated by p300 and regulates gene transcription via modulation of histone acetylation.J Biol Chem,2007,282:33994-34002.

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本刊編輯部

EffectofKLF4overexpressiononpalmitate-inducedinsulinresistanceinL6skeletonmusclecellsofrats

ZHANGZhe,WANGChao.KeyLaboratoryaboutGeriatricMedicine,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the effect of Krüppel-like factor 4 (KLF4) overexpression on palmitate-induced insulin resistance in L6 skeleton muscle cells of rats.MethodsThe insulin resistance models in L6 skeleton muscle cells of rats were induced by palmitic acid,which were randomly divided into two groups,control group and experiment group.The differentiated L6 skeleton muscle cells in control group were transfected with adenovirus empty vector (Ad),however,which in experiment group were transfected with KLF4 adenovirus expression vector (Ad-KLF4).The expression levels of KLF4,insulin receptor (IR) and glucose transporter type 4 (GLUT4) in both groups were detected by Real-time PCR and Western Blot.ResultsAs compared to those in control group,the expression levels of KLF4,IR and GLUT4 in experiment group were significantly down-regulated (P<0.05),and the intaking amount for glucose was obviously decreased (P<0.05).The overexpression of KLF4 could enhance the sensitivities of the cells to insulin,and could up-regulate the expression levels of IR and GLUT4.ConclusionKLF4 overexpression can up-regulate the expression levels of IR and GLUT4,and can improve insulin sensitivities of L6 cells effectively.

Krüppel-like factor 4;gene transfection;skeletal muscle cell;insulin resistance

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.001

項(xiàng)目來源：河北省自然科學(xué)基金(編號(hào)：C2011307008)

050051 河北省石家莊市，河北省人民醫(yī)院省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

王超，050051 河北省石家莊市，河北省人民醫(yī)院省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

E-mail：13731156811@163.com

R 347.8

A

1002-7386(2014)02-0165-03

203-08-07)