吳佳寧

摘要：綜述了豬卵母細(xì)胞的冷凍保存方法和解凍方法，同時(shí)對(duì)影響冷凍的因素、保護(hù)劑的選擇等方面進(jìn)行了探討并對(duì)豬卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞；冷凍保存；豬

中圖分類號(hào)：S814.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1007-273X（2014）05-0071-02

近年來，隨著動(dòng)物胚胎生物技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)卵母細(xì)胞的需求日益增加，僅通過回收體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞已經(jīng)無法滿足科研和生產(chǎn)的需要。而從屠宰場回收廢棄卵巢加以利用以獲取大量卵母細(xì)胞，可望成為一條有效的途徑。豬卵母細(xì)胞冷凍保存有助于優(yōu)良地方豬種種質(zhì)資源的保護(hù)，有助于資源共享與交換。動(dòng)物卵母細(xì)胞是母系遺傳信息的載體，通過冷凍保存動(dòng)物的卵母細(xì)胞，不但可以建立雌性動(dòng)物的基因庫，還可充分利用卵母細(xì)胞資源，使體外受精、轉(zhuǎn)基因和核移植技術(shù)研究不受時(shí)間和地域的限制。另一方面，通過體外受精實(shí)現(xiàn)胚胎的體外生產(chǎn)，也可為胚胎生物技術(shù)提供豐富的材料來源；通過“試管動(dòng)物”的生產(chǎn)，為克服珍稀瀕危動(dòng)物的生殖疾病提供良好的解決方案。豬卵母細(xì)胞冷凍的研究還可為豐富低溫生物學(xué)的理論、方法和實(shí)踐提供重要的依據(jù)。

1豬卵母細(xì)胞的冷凍保存方法

1.1玻璃化冷凍

玻璃化冷凍是把卵母細(xì)胞置于高濃度冷凍保護(hù)液中，經(jīng)過短時(shí)間平衡（1～2 min） 或不平衡，直接投入液氮保存。它是超快速降低細(xì)胞溫度的一種冷凍模式，一般是將經(jīng)過不同防凍劑濃度平衡的卵母細(xì)胞由0 ℃以上溫度直接浸入液氮中保存。目前，玻璃化冷凍多采用兩步法，即先用低濃度的冷凍保護(hù)劑預(yù)平衡3～5 min，再放入終濃度冷凍液，立即裝管，經(jīng)液氮熏蒸1～2 min后或不熏蒸而直接投入液氮。該法的特點(diǎn)是細(xì)胞在室溫脫水后不需要降溫程序，簡便易行，該過程中水分在細(xì)胞內(nèi)外都要結(jié)晶。

1.2程序化冷凍

卵母細(xì)胞用冷凍保護(hù)劑平衡處理后，以1 ℃/ min 速度降溫，在-5～-7 ℃誘發(fā)結(jié)晶，然后以0.3～0.8 ℃/ min的速度降溫至-30～-40 ℃，投入液氮中保存。該法是程序化冷凍的基礎(chǔ)程序。將GV期或MII期卵母細(xì)胞在TCM199中洗2～3次，轉(zhuǎn)移到冷凍保護(hù)劑中，進(jìn)行逐步濃度梯度平衡。首先，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3%EG中平衡5 min，再轉(zhuǎn)移到6%EG中平衡5 min，最后轉(zhuǎn)移到9%EG中平衡5 min，并裝入0.25 mL的塑料麥管，每管含卵母細(xì)胞約15枚。

裝管順序和各部分的量分別為：冷凍液（4 cm）→空氣（0.5 cm）→含卵母細(xì)胞冷凍液（2 cm）→空氣

摘要：綜述了豬卵母細(xì)胞的冷凍保存方法和解凍方法，同時(shí)對(duì)影響冷凍的因素、保護(hù)劑的選擇等方面進(jìn)行了探討并對(duì)豬卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞；冷凍保存；豬

中圖分類號(hào)：S814.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1007-273X（2014）05-0071-02

近年來，隨著動(dòng)物胚胎生物技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)卵母細(xì)胞的需求日益增加，僅通過回收體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞已經(jīng)無法滿足科研和生產(chǎn)的需要。而從屠宰場回收廢棄卵巢加以利用以獲取大量卵母細(xì)胞，可望成為一條有效的途徑。豬卵母細(xì)胞冷凍保存有助于優(yōu)良地方豬種種質(zhì)資源的保護(hù)，有助于資源共享與交換。動(dòng)物卵母細(xì)胞是母系遺傳信息的載體，通過冷凍保存動(dòng)物的卵母細(xì)胞，不但可以建立雌性動(dòng)物的基因庫，還可充分利用卵母細(xì)胞資源，使體外受精、轉(zhuǎn)基因和核移植技術(shù)研究不受時(shí)間和地域的限制。另一方面，通過體外受精實(shí)現(xiàn)胚胎的體外生產(chǎn)，也可為胚胎生物技術(shù)提供豐富的材料來源；通過“試管動(dòng)物”的生產(chǎn)，為克服珍稀瀕危動(dòng)物的生殖疾病提供良好的解決方案。豬卵母細(xì)胞冷凍的研究還可為豐富低溫生物學(xué)的理論、方法和實(shí)踐提供重要的依據(jù)。

1豬卵母細(xì)胞的冷凍保存方法

1.1玻璃化冷凍

玻璃化冷凍是把卵母細(xì)胞置于高濃度冷凍保護(hù)液中，經(jīng)過短時(shí)間平衡（1～2 min） 或不平衡，直接投入液氮保存。它是超快速降低細(xì)胞溫度的一種冷凍模式，一般是將經(jīng)過不同防凍劑濃度平衡的卵母細(xì)胞由0 ℃以上溫度直接浸入液氮中保存。目前，玻璃化冷凍多采用兩步法，即先用低濃度的冷凍保護(hù)劑預(yù)平衡3～5 min，再放入終濃度冷凍液，立即裝管，經(jīng)液氮熏蒸1～2 min后或不熏蒸而直接投入液氮。該法的特點(diǎn)是細(xì)胞在室溫脫水后不需要降溫程序，簡便易行，該過程中水分在細(xì)胞內(nèi)外都要結(jié)晶。

1.2程序化冷凍

卵母細(xì)胞用冷凍保護(hù)劑平衡處理后，以1 ℃/ min 速度降溫，在-5～-7 ℃誘發(fā)結(jié)晶，然后以0.3～0.8 ℃/ min的速度降溫至-30～-40 ℃，投入液氮中保存。該法是程序化冷凍的基礎(chǔ)程序。將GV期或MII期卵母細(xì)胞在TCM199中洗2～3次，轉(zhuǎn)移到冷凍保護(hù)劑中，進(jìn)行逐步濃度梯度平衡。首先，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3%EG中平衡5 min，再轉(zhuǎn)移到6%EG中平衡5 min，最后轉(zhuǎn)移到9%EG中平衡5 min，并裝入0.25 mL的塑料麥管，每管含卵母細(xì)胞約15枚。

裝管順序和各部分的量分別為：冷凍液（4 cm）→空氣（0.5 cm）→含卵母細(xì)胞冷凍液（2 cm）→空氣

摘要：綜述了豬卵母細(xì)胞的冷凍保存方法和解凍方法，同時(shí)對(duì)影響冷凍的因素、保護(hù)劑的選擇等方面進(jìn)行了探討并對(duì)豬卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞；冷凍保存；豬

中圖分類號(hào)：S814.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1007-273X（2014）05-0071-02

近年來，隨著動(dòng)物胚胎生物技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)卵母細(xì)胞的需求日益增加，僅通過回收體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞已經(jīng)無法滿足科研和生產(chǎn)的需要。而從屠宰場回收廢棄卵巢加以利用以獲取大量卵母細(xì)胞，可望成為一條有效的途徑。豬卵母細(xì)胞冷凍保存有助于優(yōu)良地方豬種種質(zhì)資源的保護(hù)，有助于資源共享與交換。動(dòng)物卵母細(xì)胞是母系遺傳信息的載體，通過冷凍保存動(dòng)物的卵母細(xì)胞，不但可以建立雌性動(dòng)物的基因庫，還可充分利用卵母細(xì)胞資源，使體外受精、轉(zhuǎn)基因和核移植技術(shù)研究不受時(shí)間和地域的限制。另一方面，通過體外受精實(shí)現(xiàn)胚胎的體外生產(chǎn)，也可為胚胎生物技術(shù)提供豐富的材料來源；通過“試管動(dòng)物”的生產(chǎn)，為克服珍稀瀕危動(dòng)物的生殖疾病提供良好的解決方案。豬卵母細(xì)胞冷凍的研究還可為豐富低溫生物學(xué)的理論、方法和實(shí)踐提供重要的依據(jù)。

1豬卵母細(xì)胞的冷凍保存方法

1.1玻璃化冷凍

玻璃化冷凍是把卵母細(xì)胞置于高濃度冷凍保護(hù)液中，經(jīng)過短時(shí)間平衡（1～2 min） 或不平衡，直接投入液氮保存。它是超快速降低細(xì)胞溫度的一種冷凍模式，一般是將經(jīng)過不同防凍劑濃度平衡的卵母細(xì)胞由0 ℃以上溫度直接浸入液氮中保存。目前，玻璃化冷凍多采用兩步法，即先用低濃度的冷凍保護(hù)劑預(yù)平衡3～5 min，再放入終濃度冷凍液，立即裝管，經(jīng)液氮熏蒸1～2 min后或不熏蒸而直接投入液氮。該法的特點(diǎn)是細(xì)胞在室溫脫水后不需要降溫程序，簡便易行，該過程中水分在細(xì)胞內(nèi)外都要結(jié)晶。

1.2程序化冷凍

卵母細(xì)胞用冷凍保護(hù)劑平衡處理后，以1 ℃/ min 速度降溫，在-5～-7 ℃誘發(fā)結(jié)晶，然后以0.3～0.8 ℃/ min的速度降溫至-30～-40 ℃，投入液氮中保存。該法是程序化冷凍的基礎(chǔ)程序。將GV期或MII期卵母細(xì)胞在TCM199中洗2～3次，轉(zhuǎn)移到冷凍保護(hù)劑中，進(jìn)行逐步濃度梯度平衡。首先，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3%EG中平衡5 min，再轉(zhuǎn)移到6%EG中平衡5 min，最后轉(zhuǎn)移到9%EG中平衡5 min，并裝入0.25 mL的塑料麥管，每管含卵母細(xì)胞約15枚。

裝管順序和各部分的量分別為：冷凍液（4 cm）→空氣（0.5 cm）→含卵母細(xì)胞冷凍液（2 cm）→空氣