王曉慧 陳 虹

肺癌已躍居我國城鄉(xiāng)惡性腫瘤病死率的首位。因?yàn)槎鄶?shù)患者在初次診斷時(shí)已處于晚期，且晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)對(duì)放化療敏感性不高，故5年生存率低，預(yù)后差。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)及表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)如厄洛替尼、吉非替尼的研究的不斷深入和臨床使用，讓晚期NSCLC的治療見到了曙光。而EGFR基因突變的患者對(duì)EGFR-TKI更敏感[1-3]。因此，EGFR突變檢測(cè)成為肺癌靶向治療的預(yù)測(cè)手段[4-5]。研究表明，EGFR基因的突變種類及突變率具有地區(qū)和種族差異。中國NSCLC患者EGFR突變率大于美國NSCLC患者[6]。在中國各省市的NSCLC患者EGFR突變的具體表現(xiàn)也不完全一致，安徽省以外顯子19突變?yōu)橹?。臺(tái)灣地區(qū)則以外顯子21突變?yōu)橹?，而上海的資料顯示兩者之間無差異[7-9]。外顯子19、21的突變特征也存在矛盾。Li等[10]對(duì)中國大陸的NSCLC患者EGFR突變研究顯示，在女性、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者以外顯子21突變?yōu)橹?，外顯子19突變更常見于Ⅰ和Ⅱ期。而李梅芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)外顯子19、21突變與患者年齡、性別、腫瘤TNM分期、吸煙狀態(tài)、標(biāo)本來源、組織學(xué)類型均無明顯相關(guān)性。為進(jìn)一步探討EGFR基因突變的差異，本研究用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)檢測(cè)重慶地區(qū)EGFR突變。了解重慶地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變情況及其與臨床病理特征的關(guān)系。

材料與方法

一、 臨床資料

回顧性分析2011年9月至2013年1月經(jīng)病理或細(xì)胞學(xué)檢查確診為NSCLC，并在重慶醫(yī)科大學(xué)分子檢測(cè)中心行EGFR基因突變檢測(cè)的病例55例。其中，男32例，女23例。大于60歲29例，小于等于60歲26例。吸煙27例，不吸煙28例。非鱗癌42例(腺癌40例，腺鱗癌2例)，鱗癌13例。甲醛固定石蠟標(biāo)本40例，胸水標(biāo)本15例。依據(jù)國際防癌聯(lián)盟2009版對(duì)所有NSCLC患者進(jìn)行臨床分期。Ⅰ期6例，Ⅱ期5例，Ⅲ期16例，Ⅳ期28例。依據(jù)1997年WHO吸煙定義：一生中吸煙連續(xù)或累積吸煙6個(gè)月或以上者，反之為非吸煙者。

二、 DNA提取及檢測(cè)方法

1. 石蠟組織標(biāo)本DNA提?。航?jīng)病理確認(rèn)為腫瘤組織的石蠟標(biāo)本，脫蠟后利用凱杰公司QIAamp FFPE組織DNA提取試劑盒(Cat NO.56404)提取DNA。所有步驟按石蠟樣品DNA 提取試劑盒操作說明操作。所提DNA需用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，其OD260/OD280在1.8～2.0內(nèi)。提取完的DNA立即進(jìn)行EGFR檢測(cè)。

2. 胸水標(biāo)本DNA提取: 收集經(jīng)鏡下脫落細(xì)胞檢測(cè)確定含肺癌細(xì)胞的新鮮胸水標(biāo)本。以離心半徑 8 cm，2000 r/min常溫下離心15 min，去上清液，收集沉淀物。采用凱杰公司QIAamp組織DNA提取試劑盒(Cat NO.69506)提取DNA，所有步驟按組織標(biāo)本提取試劑盒操作說明進(jìn)行。所提取的DNA需用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，其OD260/OD280在1.8～2.0內(nèi)。提取完的DNA立即進(jìn)行EGFR檢測(cè)。

3. ARMS法檢測(cè)EGFR：所有提取DNA均采用ADx-ARMS人類EGFR基因29種突變檢測(cè)試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)，檢測(cè)EGFR基因外顯子18、19、20、21共29種權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的已知常見突變。所有步驟及結(jié)果解讀均按ADx-ARMS 試劑盒操作說明書進(jìn)行操作。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件處理檢測(cè)數(shù)據(jù)，組間率的比較行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；外顯子19、21突變特征分析采用Fisher精確檢驗(yàn)法(總例數(shù)小于40)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 EGFR突變位點(diǎn)分析

在55例NSCLC患者中，檢測(cè)出EGFR突變14例(25.45%)，其中外顯子19突變8例(57.14%，8/14)，外顯子21突變5例(35.71%，5/14)，外顯子18、20同時(shí)突變1例(7.15%，1/14)，見表1。

表1 14例NSCLC患者EGFR體細(xì)胞突變位點(diǎn)

二、EGFR突變與臨床特征的關(guān)系分析

非鱗癌(腺癌、腺鱗癌)EGFR突變率為33.33%(14/42)，13例鱗癌無突變(0/13)。女性NSCLC患者EGFR基因突變率顯著大于男性患者(P=0.009)。不吸煙NSCLC患者EGFR突變率大于吸煙患者(P=0.017)。非鱗癌(腺癌、腺鱗癌)突變大于鱗癌患者(P=0.041)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于年齡、TNM分期、標(biāo)本種類、病理類型分組EGFR基因突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

三、 EGFR基因外顯子19、21突變特征分析

外顯子19、21突變與年齡相關(guān)。60歲以下以外顯子19突變?yōu)橹鳎?0歲以上的則以外顯子21多見。外顯子19、21突變與性別、吸煙狀態(tài)、TNM分期、病理類型、標(biāo)本種類無明顯相關(guān)，見表3。

討 論

EGFR基因突變的晚期NSCLC患者用EGFR-TKI比使用化療具有更長的無進(jìn)展生存期[12]。Heon等[13]也研究證實(shí)，EGFR基因突變的晚期NSCLC患者，用易瑞沙治療組較化療組相比，具有更低的中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患者使用EGFR-TKI比化療具有更好的臨床獲益。

表2 NSCLC患者EGFR基因突變與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

EGFR基因突變具有種族及地區(qū)差異。Sekine等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在亞洲NSCLC患者EGFR總的突變率為31%，遠(yuǎn)高于歐美患者的7%。本研究中，NSCLC總的突變率25.45%，較亞洲多中心調(diào)查的平均突變率稍低，但仍較歐美國家突變率高。Xu等[15]針對(duì)中國大陸NSCLC患者的研究提示，總突變率30.2%，女性患者突變率30.2%。本研究中，女性患者EGFR基因突變率為43.48%，處于較高水平。

多項(xiàng)研究提示，NSCLC患者EGFR突變與臨床特征相關(guān)。臺(tái)灣地區(qū)大樣本、多中心研究提示女性、腺癌、非吸煙患者使用厄洛替尼治療，具有更長的無進(jìn)展生存期[16]。Kim等[17]對(duì)202例肺癌患者研究發(fā)現(xiàn)，女性(52.1vs. 13.0%)、非吸煙(47.8vs. 15.8%)、腺癌(35.2vs. 5.2%)患者具有更高的EGFR突變率。這一結(jié)論也多次得到其它研究證實(shí)[1,18]。本研究亦同樣提示女性(43.48vs. 12.5%)、非吸煙(39.29vs. 11.11%)、非鱗癌(腺癌、腺鱗癌)(33.33vs. 0.00%)患者的EGFR突變率更高，與前面研究結(jié)果相一致。Shiozawa等[19]對(duì)67例腺鱗癌患者研究證實(shí)，腺鱗癌EGFR基因突變與腺癌具有相似的臨床病理特征，故推測(cè)腺鱗癌中EGFR突變來自腺癌成分可能性大。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明EGFR基因突變與病理類型相關(guān)。也有研究提出不同觀點(diǎn)，Kim等[20]檢測(cè)57例晚期腺癌、鱗癌患者血清中EGFR基因突變，兩者突變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其發(fā)生機(jī)制及結(jié)果準(zhǔn)確性需進(jìn)一步大樣本研究證明。另外，本研究發(fā)現(xiàn)胸水標(biāo)本與石蠟組織標(biāo)本EGFR突變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。魏冰等[21]采用直接測(cè)序法檢測(cè)109例合并胸腔積液的肺腺癌患者的胸腔積液和組織標(biāo)本外顯子19、21突變，發(fā)現(xiàn)兩者突變率分別為56.88%、53.21%(P=0.35)，與本研究結(jié)果相符。何臣等[22]用同樣方法檢測(cè)30例NSCLC患者的惡性胸腔積液EGFR突變率為35%。這些研究均提示惡性胸腔積液中EGFR突變?nèi)杂休^高的檢出率，對(duì)于難以獲取組織標(biāo)本的晚期NSCLC患者可以通過惡性胸腔積液進(jìn)行EGFR檢測(cè)，從而預(yù)測(cè)EGFR-TKI的療效。

研究表明，外顯子19、21的突變也具有一定的臨床病理特征。目前發(fā)現(xiàn)EGFR突變位以外顯子19、21突變?yōu)橹?，與本研究結(jié)果相符[23]。Li等[10]對(duì)中國大陸的NSCLC患者EGFR突變研究顯示，在女性、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或Ⅲ-Ⅳ期患者以外顯子21突變?yōu)橹?，而外顯子19突變更常見于I和II期NSCLC患者，提示外顯子19突變比外顯子21突變具有較低的惡性傾向。另外，外顯子19突變更常見于左肺肺癌，外顯子21突變更常見于右肺肺癌。也有研究呈現(xiàn)相反的觀點(diǎn)，李梅芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)外顯子19、21突變與患者年齡、性別、肺癌TNM分期、吸煙狀態(tài)、標(biāo)本來源、組織學(xué)類型均無明顯相關(guān)性。本研究首次發(fā)現(xiàn)60歲以下以外顯子19突變?yōu)橹鳎?0歲以上以外顯子21突變?yōu)橹?。考慮這些差異與病例遺傳背景、檢測(cè)方法、樣本量、EGFR突變機(jī)制等多因素相關(guān)，仍需進(jìn)一步大樣本研究探索EGFR外顯子19、21突變與年齡相關(guān)的機(jī)制及臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，不同的外顯子突變具有不同的臨床意義。Fukuoka等[24]研究發(fā)現(xiàn)，外顯子19、21突變對(duì)化療的有效率為43.2%、53.2%，對(duì)易瑞沙治療的有效率為84.8%、60.9%。Jackman等[25]也研究證實(shí)，外顯子19突變比外顯子21突變的患者用厄洛替尼或吉非替尼治療具有更好的無進(jìn)展生存期和總生存期獲益。故外顯子19比外顯子21在療效上更具優(yōu)勢(shì)。多項(xiàng)研究表明，外顯子20的T790M突變與EGFR-TKI的獲得性耐藥有關(guān)[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)外顯子18、20同時(shí)突變1例，其突變的臨床意義仍需要進(jìn)一步研究。

EGFR-TKI已成為晚期NSCLC的主要治療方式。目前關(guān)于EGFR基因突變的狀態(tài)、與臨床病理特征的關(guān)系及其臨床意義的報(bào)道結(jié)果存在相互矛盾的地方，這可能與各地患者的遺傳背景、生活環(huán)境及肺癌的EGFR突變的發(fā)生機(jī)制相關(guān)。為進(jìn)一步優(yōu)化EGFR-TKI治療方案，延長NSCLC 患者的PFS 和OS，改善生活質(zhì)量，獲得更高的社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值，仍需進(jìn)一步深入研究EGFR基因的突變。

參 考 文 獻(xiàn)

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