田玉旺 許春偉 高文斌 張玉萍 李 揚(yáng) 亓崠東

在全球范圍內(nèi)，肺癌已躍居為發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1-2]。肺癌中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占80～85%[3]。EML4-ALK是2007年發(fā)現(xiàn)的由棘皮動物微管相關(guān)蛋白 4(echinoderm microtubule associated protein-like 4,EML4)與漸變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因融合而成的肺癌特異性融合基因，其在肺癌患者中的陽性率約為3%～8%[4]。EML4-ALK融合基因陽性具有與EGFR基因突變互斥性。NSCLC患者中最常見的EML4-ALK融合基因變異體是變異體1、2和3。變異體1的陽性率約為33%，變異體3的陽性率約為29%，變異體2的陽性率約為9%，這3種變異體占所有變異體的大多數(shù)，其他的多種變異體所占比例均較低[5-11]。

胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,TYMS)編碼的酶是dTMP從頭合成的限速酶，在DNA合成、復(fù)制和修復(fù)中起著極其重要的作用[12]，它可導(dǎo)致DNA斷裂并使細(xì)胞死亡，成為目前部分抗腫瘤藥物重要的有效靶點(diǎn)。研究表明多種惡性腫瘤組織TYMS活性顯著高于正常組織[13]。通過調(diào)節(jié)p53表達(dá)影響周期從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖，TYMS與腫瘤增殖狀態(tài)相關(guān)[14-15]，TYMS過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞群具有生長優(yōu)勢潛能，提示TYMS高表達(dá)和不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。

肺癌患者TYMS低表達(dá)時，其對一線化療藥培美曲塞(pemetrexed,ALIMTA)的有效性提高[16-17]。本研究通過多中心研究回顧257例Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者中EML4-ALK融合基因與TYMS mRNA表達(dá)情況并對其相互其關(guān)系進(jìn)行分析，旨在了解NSCLC患者EML4-ALK融合基因與組織中這種耐藥基因表達(dá)情況的關(guān)系，為進(jìn)一步探索EML4-ALK融合基因患者更有效的個體化治療方案。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 資料來源：收集解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院、大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院、山東省濰坊市人民醫(yī)院2004年至2013年間進(jìn)行手術(shù)，術(shù)后病理診斷為肺腺癌且術(shù)前未經(jīng)化療、放療及生物免疫治療的組織蠟塊標(biāo)本257例(其中解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院103例，大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院58例，山東省濰坊市人民醫(yī)院96例)，進(jìn)行EML4-ALK融合基因和TYMS mRNA檢測。

2. 主要試劑和儀器：DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，RNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，EML4-ALK基因表達(dá)檢測試劑盒(福建廈門艾德有限公司)，腫瘤相關(guān)基因表達(dá)量相對定量檢測試劑盒(TYMS，福建廈門艾德有限公司)，核酸蛋白質(zhì)濃度測量儀B-500(上海創(chuàng)萌生物科技有限公司)，Mx3000P實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)。

二、研究方法

1. 實(shí)時熒光定量PCR檢測EML4-ALK融合基因：取4 μm厚度的石蠟組織切片4～8片，脫蠟；按照提取基因組RNA試劑盒(德國QIAGEN公司)說明書提供的方法提取組織RNA，應(yīng)用分光光度計檢測所提取RNA 的純度和濃度。按照EML4-ALK基因表達(dá)檢測試劑盒(福建廈門艾德有限公司)說明書提供的方法，在ABI7500 實(shí)時熒光定量PCR儀(美國life tech公司)中進(jìn)行擴(kuò)增，該試劑盒包含擴(kuò)增EML4-ALK基因9種融合突變的引物及探針。

2. 實(shí)時熒光定量PCR檢測NSCLC組織中TYMS mRNA的表達(dá)：取4 μm厚度的石蠟組織切片4～8片，脫蠟；按照提取基因組RNA試劑盒(德國QIAGEN公司)說明書提供的方法提取組織RNA，應(yīng)用分光光度計檢測所提取RNA 的純度和濃度。按照腫瘤相關(guān)基因表達(dá)檢測試劑盒(TYMS，福建廈門艾德有限公司)說明書提供的方法，ABI7500 實(shí)時熒光定量PCR儀(美國life tech公司)中進(jìn)行擴(kuò)增。用絕對定量法，以β-actin為內(nèi)參基因?qū)YMS基因mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測。TYMS標(biāo)準(zhǔn)均值為4.21×10-3(福建廈門艾德有限公司)。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果運(yùn)用χ2及Fisher確切概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，并設(shè)定P值為雙側(cè)分布，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、EML4-ALK融合基因和TYMS mRNA表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系，見表1、圖1。

257例NSCLC組織中EML4-ALK融合基因陽性11例(4.28%)；不吸煙者中EML4-ALK融合基因陽性率7.0%，顯著高于吸煙者(P=0.007)，但與患者的性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及臨床分期等臨床特征無關(guān)。257例NSCLC組織中TYMS mRNA高表達(dá)者163例(63.42%)，低表達(dá)者94例(36.58%)；TYMS mRNA表達(dá)水平與患者的性別、年齡、吸煙情況、腫瘤大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及臨床分期等臨床特征無關(guān)。

表1 EML4-ALK融合基因與TYMS mRNA表達(dá)與患者臨床特征間的關(guān)系

圖1 TYMS低表達(dá)

二、EML4-ALK融合基因與TYMS mRNA表達(dá)水平間的關(guān)系，見表2。

11例EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者中，TYMS mRNA低表達(dá)者8例(72.73%)；246例EML4-ALK融合基因陰性的NSCLC患者中，TYMS mRNA低表達(dá)者86例(34.96%)，EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者傾向于TYMS mRNA低表達(dá)(72.73%vs. 34.96%，P<0.05)。

表2 NSCLC組織中EML4-ALK融合基因與TYMS mRNA表達(dá)水平間的關(guān)系

討 論

EML4-ALK基因融合的選擇性抑制劑克唑替尼(crizotinib，商品名：賽可瑞)在NSCLC患者的臨床實(shí)驗(yàn)中，由于Ⅰ期、Ⅱ期的臨床試驗(yàn)收到了較好的效果，且不良反應(yīng)小，患者耐受性好，目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)。但2010年，Choi等[18]報道了1例EML4-ALK陽性的NSCLC患者，在經(jīng)過5個月克唑替尼治療后產(chǎn)生繼發(fā)耐藥，并發(fā)現(xiàn)2種點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)為(C1156Y和L1196M)。因此進(jìn)一步探索克唑替尼原發(fā)或繼發(fā)耐藥對患者的個體化治療方案顯得非常具有實(shí)用價值和現(xiàn)實(shí)意義[19]。

本研究結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者中EML4-ALK融合基因陽性率為4.28%(11/257)，在不吸煙患者中較高(P<0.05)，與國內(nèi)至今已報道的四個研究中，EML4-ALK融合基因陽性率為6.40%(31/484)相比略微偏低[8,20-22]。本組NSCLC患者中，TYMS的高表達(dá)率為63.42%(163/257)，與Ganda等[23]研究結(jié)果基本一致，且TYMS表達(dá)水平均與患者的性別、年齡、吸煙情況、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和病理分期等臨床特征無關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者中，EML4-ALK融合基因與TYMS表達(dá)水平有關(guān)(P<0.05)，EML4-ALK融合基因陽性患者TYMS呈低表達(dá)者較多。化療耐受是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的主要原因之一。短期應(yīng)用培美曲塞化療后，可能出現(xiàn)TYMS誘導(dǎo)，而導(dǎo)致TYMS過表達(dá)、催化活性升高，使腫瘤細(xì)胞耐藥。TYMS高表達(dá)使增殖期細(xì)胞DNA合成修復(fù)能力增強(qiáng)，從而使肺癌細(xì)胞不易被化療藥物殺死導(dǎo)致耐藥，TYMS低表達(dá)卻不易形成對培美曲塞耐藥，增加了化療有效的機(jī)會。這可能是EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者對化療有較高的反應(yīng)率內(nèi)在機(jī)制的一個理論依據(jù)。

本研究初步明確了NSCLC患者EML4-ALK融合基因陽性患者中TYMS傾向低表達(dá)，推測EML4-ALK融合基因陽性患者應(yīng)用培美曲塞化療有效率高，但其內(nèi)在的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究組以對化療藥中的鉑類和他濱類藥物耐藥基因與EML4-ALK融合基因相互關(guān)系進(jìn)行研究，而此次僅對培美曲塞耐藥基因與EML4-ALK融合基因相互關(guān)系進(jìn)行了研究，并未對一線化療藥中的微管類藥物耐藥基因TUBB3進(jìn)行研究。因此期待關(guān)于EML4-ALK融合基因與微管類耐藥基因TUBB3的研究和進(jìn)一步探索更有效的個體化治療方案，特別是對EML4-ALK融合基因選擇性抑制劑克唑替尼原發(fā)或繼發(fā)耐藥患者的個體化治療方案的研究報道。

參 考 文 獻(xiàn)

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