夏世金 高 文 胡明冬 劉露梅 邰先桃

環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)或稱環(huán)形RNA，是新近確認(rèn)的一類特殊的非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)分子，是繼microRNA(miRNA)后RNA家族的一顆極具發(fā)展?jié)摿Φ恼谏鸬男滦?，也是RNA領(lǐng)域最新的研究熱點(diǎn)，方興未艾。通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用，circRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，有巨大潛力成為新型的臨床診斷標(biāo)志物。

circRNA是一類主要由一個以上外顯子構(gòu)成的環(huán)形RNA分子，大量存在于真核細(xì)胞，具有一定的組織、時序和疾病特異性。circRNA最先在植物類病毒中被發(fā)現(xiàn)[1]，隨后在研究腫瘤抑制基因DCC、人Ets-1基因及小鼠Sry基因時，發(fā)現(xiàn)從核前體mRNA(precursor messenger RNA, pre-mRNA)加工而來的RNA呈環(huán)狀[2-5]，表明真核細(xì)胞中也存在著非線性RNA： circRNA。早期，關(guān)于circRNA的文獻(xiàn)報道少，且表達(dá)水平低下，故在很長一段時間里，circRNA被認(rèn)為是錯誤可變剪接(alternative splicing )而形成的副產(chǎn)品，屬于自然界中一種極罕見現(xiàn)象[5-6]，甚至被當(dāng)做遺傳意外或?qū)嶒炄藶橐蛩厮拢⑽匆饘W(xué)術(shù)界重視。

隨著RNA測序(RNA sequencing, RNA-seq)和生物信息學(xué)等技術(shù)的快速發(fā)展，人們在大規(guī)模研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)，circRNA并不像之前所認(rèn)為的那樣是一種極罕見現(xiàn)象，反而大量存在于真核細(xì)胞中。Danan等[6]發(fā)現(xiàn)，circRNA在古生菌細(xì)胞普遍存在，并認(rèn)為其極有可能具有生物學(xué)功能。同時，Salzman等[7]也證實circRNA在人類細(xì)胞基因表達(dá)中是一個普遍現(xiàn)象，并可能扮演著多種生物學(xué)功能的重要角色。Jeck等[8]采用高通量測序方法，在人成纖維細(xì)胞中檢測到超過25 000種circRNA，認(rèn)為circRNA是RNA剪切后所形成的一類極穩(wěn)定的保守性產(chǎn)物，此外還發(fā)現(xiàn)circRNA可被小型干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)降解。Memczak等[9]研究證實circRNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，Hansen等[10]的研究則揭示circRNA可作為miRNA海綿(miRNA sponge)來影響基因的調(diào)控與表達(dá)。盡管circRNA被發(fā)現(xiàn)已有30余年，但由于技術(shù)限制等原因，circRNA一直處于被學(xué)術(shù)界忽視的地位。但隨著近年有關(guān)circRNA的幾項突破性研究的發(fā)現(xiàn)，尤其是國際著名權(quán)威刊物Nature發(fā)表兩篇有關(guān)circRNA生物學(xué)功能的論文[9-10]，震驚學(xué)術(shù)界，從此拉開揭開circRNA神秘面紗的序幕，circRNA已引起國內(nèi)外學(xué)術(shù)界的關(guān)注，并將掀起研究熱潮。

一、circRNA的形成與特征

1. circRNA的形成： 生命體的遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄從DNA傳遞到RNA，再通過翻譯傳遞到蛋白質(zhì)。通常情況下，真核生物基因在轉(zhuǎn)錄后通過前體mRNA剪接(pre-mRNA splicing)去除基因內(nèi)的非編碼內(nèi)含子序列，然后將含有蛋白編碼信息的外顯子序列順序地連接在一起，形成成熟的線形RNA分子。包括人在內(nèi)的高等真核生物可以通過可變剪接，由一個基因產(chǎn)生多種不同功能的成熟RNA及其相應(yīng)蛋白產(chǎn)物。前體mRNA可變剪接在基因組及蛋白質(zhì)組功能多樣性中發(fā)揮重要作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)約90%的人類基因都存在前體mRNA可變剪接亞型[11]。

在真核生物中存在一種反向的可變剪接，使得基因的外顯子序列反向首尾連接形成環(huán)形RNA。circRNA由特殊的前體mRNA可變剪接產(chǎn)生，剪接形式具有多樣性，其形成方式可歸結(jié)為兩大類：外顯子環(huán)化(exon circularization)和內(nèi)含子環(huán)化(intron circularization)。

Jeck等[8]提出了外顯子環(huán)化circRNA的兩種不同形成模型：套索驅(qū)動的環(huán)化(lariat-driven circularization)和內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化(intron-pairing-driven circularization)。前者與外顯子跳讀(exon skipping)有關(guān)，一個外顯子的3′剪接供體(splice donor)與另一個外顯子的5′剪接受體(splice acceptor)共價結(jié)合，即套索驅(qū)動的環(huán)化由外顯子組成的剪接供體和剪接受體共價結(jié)合，接著切除內(nèi)含子，然后形成circRNA(圖1A①)；后者則先由兩個內(nèi)含子通過堿基互補(bǔ)配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，再切除內(nèi)含子，最后形成circRNA(圖1A②)。Jeck等[8]發(fā)現(xiàn)這兩種模型均包含有互補(bǔ)性ALU重復(fù)序列的長的側(cè)翼內(nèi)含子(long flanking introns)。近期Zhang等[12]利用特殊核酸酶對環(huán)形RNA的富集，采用全新的計算分析流程，在人源胚胎干細(xì)胞H9中發(fā)現(xiàn)了近萬條環(huán)形RNA，并首次證明了內(nèi)含子RNA互補(bǔ)序列介導(dǎo)的外顯子環(huán)化(環(huán)形RNA形成)，證實外顯子環(huán)化依賴于兩側(cè)的內(nèi)含子互補(bǔ)序列，為內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化模型提供了有力證據(jù)；還發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域間內(nèi)含子互補(bǔ)序列的競爭性配對，可以選擇性地產(chǎn)生線形RNA或是環(huán)形RNA。同時，在人類基因組內(nèi)含子區(qū)域中蘊(yùn)涵著大量的互補(bǔ)序列，這些互補(bǔ)序列的選擇配對及其動態(tài)調(diào)控使得同一個基因可產(chǎn)生多個環(huán)形RNA，這種現(xiàn)象可被稱為可變環(huán)化(alternative circularization)；此前，Zhang等[13]提出了內(nèi)含子自身環(huán)化所形成的circRNA(circular intronic RNA, ciRNA)模型，揭示circRNA也可來源于內(nèi)含子(見圖1B) 。上述一系列研究的新發(fā)現(xiàn)為深入闡明circRNA的外顯子環(huán)化、內(nèi)含子環(huán)化和可變環(huán)化的機(jī)制奠定了理論根基，以全新的理論視角揭示了基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)錄后水平的復(fù)雜性和多樣性。

注：(A)：外顯子環(huán)化形成circRNA的機(jī)制，①示套索驅(qū)動的環(huán)化，②示內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化；(B)：內(nèi)含子環(huán)化形成circRNA的機(jī)制

2. circRNA的特征： 根據(jù)目前的文獻(xiàn)報道，circRNA具有以下重要特征：(1)circRNA由特殊的可變剪切產(chǎn)生，大量存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[5]，但少部分內(nèi)含子來源的circRNA則存在于核酸內(nèi)[12]，具有一定的組織、時序和疾病特異性；(2)廣泛存在于人體細(xì)胞中，有時甚至超過它們線性異構(gòu)體的10倍之多[7-8]；(3)與傳統(tǒng)的線型RNA(linear RNA，含5'和3'末端)不同，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶RNase R降解，比線性RNA更穩(wěn)定[8,14-15]；(4)具有高度保守性[7-8]，部分具有快速的進(jìn)化性改變[12-13]；(5)大多數(shù)來源于外顯子，少部分由內(nèi)含子直接環(huán)化形成；(6)circRNA分子富含miRNA應(yīng)答元件(miRNA response element, MRE)，可充當(dāng)競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)，與miRNA結(jié)合，在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用，進(jìn)而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，上調(diào)靶基因的表達(dá)水平[10]；(7)大部分是非編碼RNA[7]。circRNA的其他特征還有待闡明。

二、 circRNA的功能

1. circRNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能： 小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(antisense to the cerebellar degeneration-related protin 1 transcript, CDR1as)是一種circRNA，擁有至少60個與微小RNA-7(microRNA-7, miR-7)相結(jié)合的保守結(jié)合位點(diǎn)，從而充當(dāng)miR-7海綿，有效影響miR-7靶基因活性[9-10]。CDR1as和miR-7在發(fā)育的中腦區(qū)域具有共同高表達(dá)的特點(diǎn)，在斑馬魚胚胎中，CDR1as的過表達(dá)造成中腦體積減少，且中腦體積的減少可通過注射miR-7前體得以部分恢復(fù)，這表明CDR1as的生物學(xué)效應(yīng)至少部分通過其與miR-7相互作用而產(chǎn)生[10]。CDR1as是miR-7的環(huán)狀抑制劑，對miR-7起負(fù)調(diào)控作用[16]，發(fā)揮天然miRNA海綿功能[17]。此外，Hansen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，睪丸特異性基因Sry的circRNA具有16個微小RNA-138(microRNA-138, miR-138)的靶位點(diǎn)，可與miR-138相互作用，充當(dāng)miR-138海綿。

circRNA充當(dāng)miRNA海綿，競爭性抑制miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，實際上代表了一類新型的ceRNA調(diào)節(jié)物(圖2A)。相較于其他類型的ceRNA，circRNA在細(xì)胞中表達(dá)量高且穩(wěn)定性強(qiáng)，并具有更多與miRNA結(jié)合的位點(diǎn)，能夠更加快速、穩(wěn)定地結(jié)合或釋放大量miRNA，高效發(fā)揮其調(diào)控miRNA的作用，比線性的ceRNA更具有突出的ceRNA活性。環(huán)狀RNA也可能是細(xì)胞外miRNA海綿，一些環(huán)狀RNA有可能存在病毒miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，與病毒miRNA的結(jié)合，從而破壞免疫應(yīng)答[9]。然而，circRNA作為miRNA海綿，與miRNA相互作用的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探明。

2. circRNA的其他功能： 除外作為miRNA的環(huán)狀抑制劑，circRNA也可能與RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein, RBP)結(jié)合(圖2B)，或者與其他RNA通過堿基互補(bǔ)配對[18-19](圖2C)。Zhang等[12]封閉內(nèi)含子環(huán)化的circRNA-ci-ankrd52的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ankrd52 mRNA表達(dá)顯著減少，表明circRNA可正調(diào)控其自身基因的表達(dá)；還發(fā)現(xiàn)此類circRNA主要位于核內(nèi)，不同于胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的circRNA，MRE較少，但能夠正調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄活性。此外，circRNA還能與阿格蛋白(argonaute, AGO)緊密結(jié)合，影響mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯[9-10](圖2B)。

注：(A)：circRNA可作為miRNA的環(huán)狀抑制劑，充當(dāng)miRNA海綿；(B)：circRNA可與蛋白結(jié)合；(C)：circRNA可與其他RNA通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合

三、 circRNA在疾病發(fā)生中的作用

通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用，circRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。人類全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)顯示，靠近基因INK4/ARF的染色質(zhì)9p21.3與動脈粥樣硬化的易感性具有單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，而有研究顯示，基因INK4/ARF可被多梳家族(polycomb group, PcG)復(fù)合物抑制[20]。circRNA cANRIL是基因INK4/ARF的反義轉(zhuǎn)錄物[21]，可通過有差異的PcG募集來抑制INK4/ARF表達(dá)，從而影響動脈粥樣硬化的發(fā)生[22]。

Hansen等[23]已證實CDR1as與miR-7在小鼠大腦中共表達(dá)，可影響中腦發(fā)育[9]。Ghosal等[24]則發(fā)現(xiàn)CDR1as亦可能與帕金森病有關(guān)。Lukiw[25]發(fā)現(xiàn)，在ciRS-7(也被稱為CDR1as)的海綿功能缺失時，miR-7表達(dá)上調(diào)，極有可能下調(diào)阿爾茨海默病相關(guān)靶點(diǎn)蛋白表達(dá)，如泛素化蛋白連接酶A[26-27]。由于miR-7可調(diào)控一些致癌基因，因而CDR1as可通過調(diào)控miR-7以影響腫瘤的產(chǎn)生[16]。circRNA在疾病發(fā)生中的作用與機(jī)制研究，目前尚處在起步階段。

四、 circRNA的研究方法

由于circRNA絕大部分由外顯子環(huán)化構(gòu)成，故在此針對性介紹外顯子環(huán)化circRNA的檢測研究方法。

1. 分子生物學(xué)方法: circRNA相較于線性RNA沒有3′端，在凝膠中移動的速度比相同長度的線性RNA慢，這種效應(yīng)可被增強(qiáng)型交聯(lián)凝膠法(increased gel cross-linking)放大[28]。然而，與同源基因形成的其他轉(zhuǎn)錄物相比較，circRNA包含有更少的總核苷酸序列，從而在弱交聯(lián)凝膠(low cross-linking gel)中移動較慢。基于此，我們可通過northern blot法來對circRNA進(jìn)行鑒別[8,29]。經(jīng)由核酸外切酶RNase H降解或單一水解后，circRNA可線性化成為大小可預(yù)測的單一產(chǎn)物[4, 30]，因此，通過雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis)或瓊脂糖凝膠電泳(gel trap electrophoresis)方法可更進(jìn)一步確認(rèn)RNA的環(huán)化[23, 28, 31]。除以上幾種方法之外，酶法(enzymatic method)分析也可為circRNA的研究提供有力支持。核酸外切酶RNase R(RNase R exonuclease)[14]、煙酸磷酸酶(tobacco acid phosphatase)[10]、終止子核酸外切酶(terminator exonuclease)[10]可降解大部分線性RNA，但不能降解circRNA，用這3種酶對特定RNA進(jìn)行處理，通過對處理前后的數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，可甄別circRNA。

套索RNA(lariat RNA)與circRNA一樣，均為環(huán)形結(jié)構(gòu)，都對核酸外切酶不敏感[14]、比線性RNA移動更慢[28]，但是，circRNA具有明顯的索尾插接序列(backsplice sequence)，能輕易與套索RNA區(qū)分。此外，套索RNA在被核酸外切酶消化前，更易被脫支酶切除，因此區(qū)分二者并不難。

2. 基因組學(xué)方法: 目前基因組學(xué)方法有兩條途徑：一條是從目前已存在的轉(zhuǎn)錄物模型(transcript models)中選取候選接頭(candidate junctions)[7, 21]，另一條是通過與基因組序列閱讀框匹配來識別接頭[32]。第一條途徑主要對來自單一cDNA片段另一端的末端配對閱讀序列(paired-end reads sequence)的獨(dú)立遺傳圖譜進(jìn)行分析[7]。第二條途徑則是通過識別來自于從哺乳動物到線蟲的損耗型rRNA的RNA-seq資料中的索尾插接序列遺傳密碼，對此類損耗型rRNA文庫(rRNA-depleted libraries)進(jìn)行分析統(tǒng)計以鑒別出circRNA[9]。此外，Danan等[6]及Jeck等[8]先用RNase R進(jìn)行消化，然后采用高通量測序的方法對RNase R不敏感RNA進(jìn)行分析，此種“CircleSeq”技術(shù)可深入分析circRNA，但需要大量的RNA輸入，且對核酸內(nèi)切酶污染極度敏感。

3. 其他: 近期，Gla?ar等[33]建立了circRNA專用數(shù)據(jù)庫“circBase”，該數(shù)據(jù)庫對目前已發(fā)表的circRNA資料進(jìn)行整合統(tǒng)一，同時提供已知的及新的circRNA測序資料，旨在為circRNA的研究提供一個較好的交流平臺。目前，Arraystar率先開發(fā)了世界上第一款商業(yè)化circRNA芯片，為系統(tǒng)探索不同生理及病理條件下circRNA的表達(dá)規(guī)律提供實驗研究平臺。circRNA的研究方法需要進(jìn)一步完善。

五、展望

目前，circRNA的命名尚未統(tǒng)一?！癱iRS-7”表明其與miR-7結(jié)合，而“CDR1as”則表明其與CDR1基因有關(guān)，盡管是同一個circRNA，但由于研究者各自的研究角度不同而造成命名的不一致，Kosik[34]則建議將之統(tǒng)一命名為circR-1。因此，亟需構(gòu)建一個更恰當(dāng)?shù)?、適用的和公認(rèn)的circRNA命名體系，以避免命名的混亂。

circRNA是RNA匣子里的一顆璀璨明珠，也是RNA家族中繼miRNA后又一顆冉冉升起的新星。盡管目前人們對circRNA的了解僅僅是冰山一角，闡明circRNA生物學(xué)功能與機(jī)制還相當(dāng)遙遠(yuǎn)，但天然生成的circRNA作為miRNA海綿，通過與miRNA相互作用從而調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，這豐富了人們對動物自然進(jìn)化的認(rèn)知，顛覆了RNA僅僅是DNA與編碼蛋白之間的平凡使者的傳統(tǒng)理念，呈現(xiàn)出成為進(jìn)化驅(qū)動者的潛能[33]。circRNA的組織特異性和穩(wěn)定性使其有可能成為一種良好的生物標(biāo)志物；circRNA與疾病發(fā)生的密切相關(guān)，通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用，circRNA在疾病發(fā)生中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，可望成為新型的疾病臨床診斷標(biāo)志物，在疾病的防治領(lǐng)域展現(xiàn)出光明的潛在的應(yīng)用前景。

參 考 文 獻(xiàn)

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