★ 郭慧玲 郭三保 趙曉娟 胡律江 胡志方* 肖小梅 許茜茜

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校 江西 撫州 344000)

羅布麻葉為夾竹桃科植物羅布麻ApocynumvenetumL.的干燥葉,在我國分布廣泛，資源豐富。羅布麻葉中含有黃酮類化合物、兒茶素等，大量實(shí)驗(yàn)研究表明其對防治高血壓和高血脂有良好的效果[1,2]。近幾年，研究報(bào)道羅布麻葉亦具有良好的抗抑郁作用，其作用可能主要與其中的黃酮類化合物特別是金絲桃苷和異槲皮素有關(guān)[3]。中藥抗抑郁的作用機(jī)制復(fù)雜，單一成分并不一定能代替藥材整體成分的藥理作用，因此，本實(shí)驗(yàn)采用羅布麻葉提取液，以總黃酮含量為考察指標(biāo)，優(yōu)化純化工藝，并比較純化前后對抗抑郁作用的影響，為羅布麻葉抗抑郁作用制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Megafugel O R高速大容量離心機(jī)(德國Thermo公司)，BT25S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，KDM型調(diào)溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)，UV759紫外-可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材與試劑 羅布麻葉購于江西省南昌市會(huì)好康大藥房(產(chǎn)地：天津)，由本校生藥教研室鄧可眾副教授鑒定為正品羅布麻。金絲桃苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111521-201205)；鹽酸氟西汀膠囊(禮來蘇州制藥有限公司，批號(hào)：2072A)；CMC-Na(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110509)；凈品級(jí)D101大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；無水乙醇、硫酸、石油醚等試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)KM小鼠60只，雌雄各半，體重18～22g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(贛)2011-0001，實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)環(huán)境7d。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 羅布麻葉的提取與純化

2.1.1 羅布麻葉提取物的制備 依據(jù)文獻(xiàn)[4]，取羅布麻葉80g置于圓底燒瓶中，加800mL40%乙醇水溶液，于70℃下回流提取3次，每次2h，過濾，合并濾液，濃縮成浸膏，按質(zhì)量平均分成兩份，編號(hào)為A、B。從A中取浸膏1.1600g(相當(dāng)于生藥材量6g)，用甲醇溶解并定溶于100mL容量瓶，編號(hào)為C，剩余浸膏編號(hào)為D，備用。

2.1.2 羅布麻葉提取純化物的制備 依據(jù)文獻(xiàn)[5]，取B用純化水溶解，離心取上清液，石油醚脫脂后濃縮成浸膏，將浸膏溶于熱水，用硫酸調(diào)節(jié)為pH=4，過濾，濾液上D101大孔樹脂柱，依次用水和50%乙醇溶液洗脫。收集乙醇洗脫液并濃縮成浸膏，取浸膏0.3175g(相當(dāng)于生藥材量6g)，用甲醇溶解并定溶于100mL容量瓶編號(hào)為E，剩余浸膏編號(hào)為F,備用。

2.2 羅布麻葉總黃酮含量測定方法的建立

2.2.1 對照品的制備 取經(jīng)五氧化二磷干燥的金絲桃苷對照品，精密稱定10.70mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.2140mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 分析方法的建立 精密量取上述對照品溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL于25mL容量瓶中，分別加純化水至6mL，精密加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min，加入10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，再加入4%氫氧化鈉溶液10mL，搖勻，用甲醇補(bǔ)足體積至刻度，搖勻，放置15min后，以相應(yīng)的試劑做空白對照，采用紫外分光光度法，于507nm波長處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=16.077C-0.0026(r=0.9999)，金絲桃苷在0.0043～0.0343mg/mL呈良好的線性關(guān)系。本方法的精密度、重現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD分別為2.91%，2.77%，回收率為98.65%。

2.2.3 樣品的測定 分別取0.5mL C和E，按“2.2.2”項(xiàng)所述方法顯色，于507nm波長處測定吸光度，由回歸方程計(jì)算出樣品中總黃酮的含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品測定結(jié)果

2.3 羅布麻葉灌胃液樣品的制備 AT(羅布麻葉提取物)和AC(羅布麻葉純化物)灌胃液的制備：分別取D和F浸膏，用1%CMC-Na定容成濃度為以生藥量計(jì)含羅布麻葉0.4，0.2g/mL的藥液，分別編號(hào)為AT高、低劑量組、AC高、低劑量組，備用。

2.4 動(dòng)物分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只雌雄各半，分組情況如下：空白組(給予20mL/kg的1%的CMC-Na水溶液)，陽性對照組(取鹽酸氟西汀膠囊50mg用1%的CMC-Na定容于50mL容量瓶即濃度為1mg/mL)，AT高劑量組、AT低劑量組、AC高劑量組、AC低劑量組。各組均連續(xù)灌胃(ig)給藥10d，每天1次，每次0.4mL/20g，末次給藥1 h后測試。

2.5 抗抑郁實(shí)驗(yàn)

2.5.1 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)(TST) 參照Steru等[6]建立的方法，并加以修改，將單個(gè)小鼠尾端(在距尾尖部約2cm處)用膠布粘于懸尾箱(35cm×35cm×20cm)上部支架上，使小鼠成倒掛狀態(tài)且頭部離箱底約5cm。小鼠為了克服不正常體位而掙扎活動(dòng)，但活動(dòng)一段時(shí)間出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，表現(xiàn)出失望狀態(tài)。懸掛時(shí)間為6min，記錄后4min內(nèi)懸尾累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。結(jié)果見表2。

2.5.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST) 參照Porsolt等[7]建立的方法，并加以修改，將小鼠單獨(dú)放入高25cm、直徑12cm的圓柱形玻璃缸中，缸內(nèi)水深10cm，水溫25±2℃，從小鼠放入水后計(jì)時(shí)6min，記錄后4min內(nèi)游泳累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。結(jié)果見表2。

2.5.3 開場實(shí)驗(yàn)(OFT) 參照Archer等[8]建立的方法。敞箱裝置為長和寬各40cm、高25cm、底面劃分為16個(gè)等邊方格的紙箱．內(nèi)面用黑漆涂滿。將小鼠放人中心方格內(nèi)，觀察小鼠4min，計(jì)算后3min穿越格數(shù)(四爪均進(jìn)入的方格方可計(jì)數(shù))，徹底清潔敞箱后再進(jìn)行下1只小鼠的觀察。結(jié)果見表2。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 羅布麻葉AT和AC對小鼠TST不動(dòng)時(shí)間的影響 與空白組對比，AT高劑量、陽性藥FH和AC高、低劑量均可顯著縮短懸尾不動(dòng)時(shí)間(P<0.05)，提示在既定給藥方案內(nèi)，AT、FH和AC在TST實(shí)驗(yàn)中均有顯著的抗抑郁作用，且AC呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系；羅布麻葉AT低劑量對此有縮短趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示AT低劑量在既定給藥方案內(nèi)沒有顯著的抗抑郁作用，見表2。

3.2 羅布麻葉AT和AC對小鼠FST不動(dòng)時(shí)間的影響 與空白組對比，AT高劑量、陽性藥FH和AC高、低劑量可顯著縮短懸尾不動(dòng)時(shí)間(P<0.05)，提示在既定給藥方案內(nèi)，AT、FH和AC在FST實(shí)驗(yàn)中均有顯著的抗抑郁作用；羅布麻葉AT低劑量對此有縮短趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示AT低劑量在既定給藥方案內(nèi)沒有顯著的抗抑郁作用，見表2。

3.3 羅布麻葉AT和AC對小鼠OFT不動(dòng)時(shí)間的影響 小鼠OFT穿格次數(shù)，各組間比較均無顯著性差異(P>0.05)，結(jié)果見表2。

表2 羅布麻葉總黃酮對小鼠TST和FST不動(dòng)時(shí)間及OFT穿格次數(shù)的影響±s，n=10)

4 討論

TST和FST是最常用的抗抑郁藥物初篩模型，其具有操作簡單、快捷、敏感度高等特點(diǎn)[9]。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠TST和FST抑郁癥模型比較羅布麻葉提取液純化前后的抗抑郁效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取液純化后由于總黃酮含量的增加，在等劑量的情況下AC比AT的抗抑郁效果更顯著，且存在顯著性差異(P<0.05)。

TST和FST抑郁癥模型幾乎對所有的抗抑郁藥都有很高的敏感性，但中藥中若含中樞興奮性成分可能影響小鼠的自主活動(dòng)，出現(xiàn)假陽性結(jié)果[10]。為避免可能出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，本文采用OFT實(shí)驗(yàn)考察各實(shí)驗(yàn)組對小鼠自主活動(dòng)的影響，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組對小鼠OFT穿格次數(shù)無明顯影響，從而排除羅布麻葉中可能含有中樞興奮性成分造成的假陽性結(jié)果。

綜上所述，羅布麻葉具有抗抑郁作用且其藥效與總黃酮的含量有關(guān)，但其作用機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

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