★ 肖移生 侯吉華 廖夫生 朱大誠

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 江西 南昌 330004)

水蛭，俗稱螞蝗。其性咸、苦、平，歸肝經(jīng)，有破血、逐瘀、通經(jīng)等功效，臨床上用于治癥瘕、痞塊、血瘀閉經(jīng)、跌打損傷等。其藥理作用為抗凝、溶栓、抗血小板及降血脂等[1]，可單方或組方用于腫瘤的治療[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，水蛭提取物對HL-60細(xì)胞生長有抑制作用[3]，為進(jìn)一步深入研究，本課題組進(jìn)行了水蛭提取物對HL-60細(xì)胞增殖與分化影響的實驗。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)方法 HL-60細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，由江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗中心保存。將HL-60細(xì)胞置于含有10%新生小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中(37℃，5%CO2飽和濕度)，培養(yǎng)至細(xì)胞處于對數(shù)生長期，備用于后續(xù)實驗。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基和新生小牛血清為美國GIBCO公司產(chǎn)品，全反式維甲酸(All trans-retinoic acid, ATRA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、佛波酯(TPA)均為美國Sigma公司產(chǎn)品，小鼠抗人CD11b、CD14 FITC熒光標(biāo)記抗體為Immunotech公司產(chǎn)品。

1.3 藥物 水蛭原藥材購于江西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)我校中藥資源學(xué)科組鄧可眾副教授鑒定且符合國家中藥臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。水蛭用超微粉碎機粉碎，提取物以液氮快速凍融法制備[4]：取水蛭超微粉1.5g置15mL離心管內(nèi)，加10mL無菌雙蒸水制成混懸液，再將離心管置液氮內(nèi)5min，取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重復(fù)3次，再3000 r/min離心10min。取上清液過濾，濾液冷凍干燥18h即得水蛭凍干粉，-20℃保存?zhèn)溆茫R用前用培養(yǎng)基配成實驗所需濃度工作液，再經(jīng)0.22μm無菌濾器正壓過濾除菌。

1.4 MTT試驗 取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，以5.0×104/mL細(xì)胞濃度置于96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，同時用水蛭提取物(根據(jù)前期實驗結(jié)果，設(shè)0.7g、1.4g、2.8g/L)再處理HL-60細(xì)胞48h，同時設(shè)對照孔，到時間點后各孔加入MTT液(20μL/孔)，每組10個復(fù)孔，4h后終止培養(yǎng)，以1000r/min離心5min，去除上清，加入DMSO(150 μL/孔)使結(jié)晶物溶解，用自動酶標(biāo)儀在波長490nm處測吸光度A值，實驗重復(fù)5次，得出量效關(guān)系。按下列公式計算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞生長抑制率(%)=(對照孔A值-試驗孔A值)/對照孔A值×100%。

1.5 NBT還原實驗檢測[5]HL-60細(xì)胞經(jīng)過水蛭提取物處理48h后，收集各實驗組的細(xì)胞(每組10個復(fù)孔)，用臺盼藍(lán)試劑檢測細(xì)胞活性并計數(shù)，取含有1×106個活細(xì)胞的100μL細(xì)胞懸液，加入100μL含2 mg/L TPA的1% NBT試劑，放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1h，離心后丟棄上清液，每個實驗組加入200μL的DMSO，混勻后加于96孔板，用酶標(biāo)儀在波長570nm處測量吸光度A值，吸光度A值越大表示細(xì)胞分化程度越高。實驗重復(fù)5次。

1.6 FCM檢測HL-60細(xì)胞膜表面CD11b、CD14抗原 HL-60細(xì)胞經(jīng)過水蛭提取物處理48h后，收集各實驗組的細(xì)胞，用臺盼藍(lán)試劑檢測細(xì)胞活性并計數(shù)，取含有5×105個細(xì)胞，PBS漂洗1次，用100μL PBS重懸細(xì)胞，分別加入20μL相應(yīng)抗體，避光孵育30min，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測，每個樣本至少檢測1×104個細(xì)胞。實驗重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.1 水蛭提取物對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用 各濃度的水蛭提取物處理HL-60細(xì)胞48h后，MTT檢測結(jié)果顯示,水蛭提取物以劑量依賴性方式抑制HL-60細(xì)胞增殖，抑制率隨水蛭提取物濃度增高而增加。各試驗組與正常組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)，詳見表1。

表1 水蛭提取物對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用

表2 水蛭提取物對HL-60細(xì)胞分化及CD11b、CD14表達(dá)的影響

圖1 水蛭提取物影響HL-60細(xì)胞表達(dá)CD11b圖

2.2 水蛭提取物對HL-60細(xì)胞分化的影響 成熟的髓系細(xì)胞(粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)具有吞噬能力，受到TPA刺激后可將黃色的NBT還原，生成藍(lán)紫色的甲簪沉淀，因此細(xì)胞對NBT的還原能力可在一定程度上反映其分化水平[5]。檢測結(jié)果顯示，水蛭提取物以劑量依賴性方式誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化，誘導(dǎo)率隨水蛭提取物濃度增高而增加。各試驗組與正常組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)，詳見表2。

2.3 水蛭提取物對HL-60細(xì)胞膜表面CD11b、CD14表達(dá)的影響 CD11b、CD14分別是粒系及單核系分化的標(biāo)記物。經(jīng)各濃度的水蛭提取物處理48h后，HL-60細(xì)胞膜表面CD11b表達(dá)升高，且隨水蛭提取物濃度增高而增加，各試驗組與正常對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，見表2、圖1。這表明水蛭提取物可以誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向成熟粒系分化，這種促分化的效果隨著水蛭提取物濃度的增加而明顯。

CD14在正常對照組的HL-60細(xì)胞與各濃度水蛭提取物處理的HL-60細(xì)胞中表達(dá)率比較，無統(tǒng)計學(xué)差異，表明水蛭提取物誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞不是朝著單核系方向分化。

3 討論

水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有破血、逐瘀、通經(jīng)等功效，廣泛用于心腦血管及血栓性疾病的治療，水蛭也是治療腫瘤疾病常用的一味活血藥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，水蛭抗腫瘤的主要活性成份有凝血酶抑制劑及蛋白酶抑制劑等，含量中主要是水蛭素、溶纖素等[6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，水蛭提取物濃度高于0.1mg/mL時對HL-60細(xì)胞有明顯的抑制作用，并呈時間和劑量依賴性。經(jīng)計算，作用HL-60細(xì)胞48h時的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL，故本研究中將水蛭提取物設(shè)為0.7g、1.4g、2.8g/L(低、中、高劑量)三個劑量作用HL-60細(xì)胞48h時間段進(jìn)行研究[3]。

NBT還原實驗和表面分化抗原的檢測兩個實驗的結(jié)合廣泛用于白血病誘導(dǎo)分化實驗的研究。NBT的還原試驗發(fā)現(xiàn)，水蛭提取物在0.7～2.8g/L劑量范圍內(nèi)以劑量依賴性方式誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化，且誘導(dǎo)率隨水蛭提取物濃度增高而增加；進(jìn)一步運用流式細(xì)胞儀檢測水蛭提取物對HL-60細(xì)胞膜表面CD11b、CD14的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)各濃度的水蛭提取物處理48h后，HL-60細(xì)胞膜表面CD11b表達(dá)升高，且隨水蛭提取物濃度增高而增加，但水蛭提取物處理HL-60細(xì)胞前后的CD14表達(dá)均為陰性。這說明水蛭提取物誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化是通過誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向成熟粒系方向分化，而非向單核系分化。

腫瘤細(xì)胞的增殖能力與其分化程度密切相關(guān)，分化程度差的細(xì)胞往往比分化程度好的細(xì)胞增殖活躍，故臨床上常通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向成熟細(xì)胞方向分化、降低細(xì)胞增殖，以達(dá)到治療腫瘤的目的[7]。研究表明，白血病的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖和分化之間的平衡失調(diào)有關(guān)，表現(xiàn)為增殖失控而分化受阻。如果藥物可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向正常體細(xì)胞分化，將明顯減輕化療藥物引起的副作用[8]。我們的實驗表明，水蛭提取物有良好的抑制HL-60細(xì)胞增殖作用，2.8g/L的水蛭提取物抑制HL-60細(xì)胞增殖率達(dá)62.25%；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，水蛭提取物也能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向成熟粒系方向分化，2.8g/L的水蛭提取物誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的CD11b表達(dá)率達(dá)34.77%±5.58%。這就說明水蛭提取物抑制HL-60細(xì)胞增殖的機理之一是通過誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向成熟粒系方向分化而發(fā)揮作用的；另外，水蛭提取物抑制HL-60細(xì)胞增殖可能還有其它作用機理，有待進(jìn)一步研究。

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[4]郭永良，田雪飛，肖竺.水蛭提取物對人肝癌HepG2細(xì)胞體外抑制作用研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16(8)：30-31.

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