★ 鄭紹琴 劉亞軍* 宋健平 高巖 鄧長生

(1.廣州中醫(yī)藥大學科技產(chǎn)業(yè)園 廣東 廣州 510445；2.廣州中醫(yī)藥大學 廣東 廣州 510405)

惡性腫瘤是對人類健康和生命威脅最嚴重的疾病之一，而肺癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，據(jù)全球2002年癌癥統(tǒng)計資料，無論從發(fā)病率和死亡率來看，肺癌都排在所有惡性腫瘤之首。目前對于腫瘤的治療主要包括手術(shù)、放射治療、化學治療和生物免疫治療?；熢诮^大多數(shù)的惡性腫瘤治療中有著重要的地位，尤其在肺癌的治療中發(fā)揮著重要的作用，但化療的有效率低，毒副作用大，中藥聯(lián)合化療藥物提高化療的有效率已成為目前研究的熱點。青蒿素artemisinin,ART)是中國藥學工作者1971年從菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的一種具有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物，因其毒性低、抗瘧性強，被WHO批準為世界范圍內(nèi)的治療腦型瘧和惡性瘧的首選藥物。近年來國內(nèi)外許多學者研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素類藥物不僅是一種抗瘧藥物，而且具有一定的抗腫瘤細胞活性和抑制腫瘤的作用。雖然在這方面目前國內(nèi)外尚缺乏大樣本的研究報道，但眾多的研究表明青蒿素及其衍生物應用于臨床腫瘤治療的前景是非常好的。本實驗旨在拓寬青蒿素作為化療輔助用藥的適應證，并初步探討青蒿素對Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及機制。

1 材料

1.1 藥物 青蒿素(廣州漢方現(xiàn)代中藥研究有限公司，批號為100651)，注射用0.5%環(huán)磷酰胺(0.2g/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號11050821)。

1.2 動物 健康C57BL/6小鼠70只，雌雄各半，4～6周齡，小鼠質(zhì)量16±2g，由廣東省實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證：SCXK(粵)2008-0002。

1.3 瘤株 小鼠Lewis瘤株，由廣州中醫(yī)藥大學青蒿中心提供。

1.4 試劑 NF-α和IFN-γ ELISA試劑盒：購于廣州博勝生物技術(shù)有限公司。

1.5 主要儀器 37XAZ型倒置顯微鏡，上海光學儀器廠；SW-CJ-IF超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；洗板機BIORAD 1575；酶標儀BIORAD MODEL 680。

2 方法

2.1 肺癌動物模型的建立 在無菌條件下，取傳代10d的Lewis肺癌瘤源小鼠，頸椎脫臼處死，無菌操作從腋部皮下剝?nèi)∧[瘤組織，研磨后按1∶3比例加生理鹽水稀釋成瘤細胞懸液，并調(diào)整細胞濃度為1×107/mL，取C57BL/6J小鼠，每鼠0.2mL右前肢腋部皮下注射。

2.2 動物分組及給藥 健康C57BL/6J小鼠70只，隨機分出10只作為正常對照組，其余動物造模24h后稱重，并隨機分為模型對照組、陽性對照組(CTX)、聯(lián)合用藥組(CTX+ART)，ART高、中、低劑量組，每組10只。分組后模型對照組和正常對照組，灌胃給予等容積CMC-Na溶液；ART高、中、低劑量組分別按200mg/kg、100mg/kg、25mg/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)12d；陽性對照組CTX按20mg/kg每鼠腹腔注射0.2mL，每日1次，連續(xù)12d；聯(lián)合用藥組CTX按20mg/kg每鼠腹腔注射0.2mL，ART按100mg/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)12d。治療期間每天觀察小鼠對治療的反應、活動情況、精神狀態(tài)、脫毛等情況。

2.3 腫瘤體積變化曲線 分組給藥后，隔天測一次各組小鼠腫瘤組織的長短徑，計算腫瘤體積：

V(mm3)=0.5×長徑×短徑×短徑

計算瘤體積，取均值繪制腫瘤體積變化曲線。

2.4 脾質(zhì)量、胸腺質(zhì)量和抑瘤率計算 末次給藥后24h，頸椎脫臼處死小鼠，剝?nèi)×鰤K，分離胸腺和脾臟并稱重。按下列公式計算抑瘤率：

2.5 聯(lián)合用藥協(xié)同作用評價 聯(lián)合用藥效果按金氏公式評價[1]：

其中Ea+b為兩藥合用的抑制率，Ea和Eb為各藥單用時的抑制率，當q<0.85時表示兩藥合用有拮抗作用；q>1.15時，表示兩藥有協(xié)同作用；當0.85

2.6 血清TNF-α和IFN-γ含量測定 第13d動物稱重后，無菌條件摘眼球取血，靜置4h，離心并分離血清，置-20℃冰箱備用。采用ELISA雙抗體夾心法測定IFN-γ、TNF-α含量。根據(jù)試劑盒的操作說明，向預先包被了IFN-γ、TNF-α多克隆抗體的酶標孔中加入待測樣品，溫育；洗滌后，依次加入底物A、B,底物(TMB)在辣根過氧化物酶(HRP)催化下轉(zhuǎn)化為藍色產(chǎn)物，再次在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品中C57小鼠IFN-γ、TNF-α的濃度呈正相關(guān)。用酶標儀測定吸光度OD值，通過標準曲線計算小鼠血清IFN-γ、TNF-α的含量。

3 結(jié)果

3.1 小鼠的一般情況觀察 在實驗前3d，各組右腋下注射部位未觸及包塊。模型組第4d開始，其它荷瘤組第6d始可在注射部位觸及稍突起于皮面的質(zhì)軟腫塊，造模的成功率為100%，皮下腫塊外觀呈球形或半球形，初起可活動，逐漸腫塊變硬；腫瘤大小不一，后期部分小鼠腫瘤表面出現(xiàn)局部潰破結(jié)痂。一般情況觀察如下:早期荷瘤C57小鼠身形勻稱，動作敏捷，皮毛黑亮，順滑有光澤，緊貼身體，無蓬松零亂，體重增長均勻，進食正常；隨著腫瘤的增長，C57小鼠逐漸出現(xiàn)狀態(tài)欠佳，進食水量減少，活動減少，行動遲緩，體重增長緩慢，至后期小鼠因腫瘤過大出現(xiàn)身體消瘦，活動遲緩，皮毛稀疏，精神萎靡，而且有脫毛情況。第13d各組陸續(xù)出現(xiàn)荷瘤小鼠死亡，其中模型對照組小鼠死亡出現(xiàn)最早。

3.2 腫瘤體積和腫瘤生長曲線圖 至6d時，幾乎所有小鼠都有大小不等的腫瘤包塊，造模成功率100%。腫瘤逐漸增大，多數(shù)腫塊為球狀或半球狀，至12d開始，部分小鼠腫瘤因過大出現(xiàn)中央皮膚暗紅并逐漸出現(xiàn)潰爛結(jié)癡，小鼠因腫瘤過大而活動受限。12d時，Model組小鼠平均腫瘤體積明顯大于各觀察組(P<0.05)，提示CTX、青蒿素有一定的抑制腫瘤生長的作用。組間比較：與Model組比較，CTX組、ART+CTX及ART200 mg/kg(P<0.01),有顯著性差異，提示CTX和ART200 mg/kg具有顯著的抑瘤作用。由表所示，隨著ART劑量的增加，腫瘤的體積逐漸縮小，提示ART的抑瘤作用與ART的劑量呈正相關(guān)。見表1和圖1。

表1 各實驗小鼠腫瘤體積比較±s)

圖1 各組小鼠腫瘤生長曲線圖

3.3 腫瘤質(zhì)量和抑瘤率 由表2看出，青蒿素各劑量組對小鼠Lewis移植性肺癌均有顯著的抑瘤作用。ART200mg/kg和100mg/kg劑量組的抑瘤率分別為36.06%、23.84%，CTX組抑瘤率為54.85%，ART聯(lián)合CTX藥物組抑瘤率為61.49%。以上各劑量藥物組與模型對照組比較，除ART25mg/kg組外，均P<0.01有顯著性差異。Model組小鼠腫瘤質(zhì)量為1.506±0.160g，顯著高于其它各組，提示青蒿素的各劑量組和CTX均有抑制Lewis肺癌荷瘤生長的作用。通過金氏公式求得聯(lián)合用藥組q=0.94,說明兩藥有相加作用。

表2 各組小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較±s)

3.4 青蒿素對小鼠免疫器官的影響 由表3可以看出，CTX組小鼠脾臟和胸腺質(zhì)量有所減輕，且ART聯(lián)合CTX組胸腺重量亦有所減輕(P<0.01)，說明CTX可使小鼠的脾臟和胸腺受到抑制，對機體有一定的毒害作用。ART200mg/kg組胸腺與Model組比較有所減輕(P<0.05)，提示ART200mg/kg對胸腺有抑制作用。ART100mg/kg和25mg/kg劑量組對小鼠脾臟和胸腺質(zhì)量無顯著性變化，提示青蒿素中低劑量對小鼠胸腺和脾臟免疫器官沒有損害，且小鼠胸腺和脾臟質(zhì)量都有所增加。

表3 青蒿素對Lewis肺癌小鼠脾臟及胸腺的影響±s)

3.5 青蒿素對Lewis肺癌小鼠血清TNF-α和IFN-γ的影響 由表4可以看出，Lewis肺癌小鼠血清TNF-α量，與Normal組比較，CTX組小鼠TNF-α量為1.018±0.191ng/mL，顯著低于Normal組(P<0.01)，具有顯著性差異，ART200mg/kg組顯著升高，ART100mg/kg和100mg/kg組雖有所升高，但不顯著(P>0.05)；與Model組比較，ART200mg/kg和100mg/kg組小鼠血清TNF-α量升高(P<0.01)，有顯著性差異。Lewis肺癌小鼠血清IFN-γ量，與Normal組比較，ART200mg/kg和100mg/kg組小鼠血清TNF-α量升高顯著(P<0.01)，有顯著性差異；與Model組比較，CTX組和聯(lián)合組有所下降(P<0.05)，有顯著性差異。ART100mg/kg和25mg/kg組升高(P<0.01)，有顯著性差異。本實驗結(jié)果顯示青蒿素高中劑量組能促進TNF-α的產(chǎn)生，且隨著劑量的增大，血清中TNF-α水平顯著提高。青蒿素各劑量組亦能促進IFN-γ的產(chǎn)生，但以ART100mg/kg組最為顯著。

表4 青蒿素對Lewis肺癌小鼠血清TNF-α和IFN-γ的影響±s)

4 討論

結(jié)果顯示：青蒿素200mg/kg和100mg/kg劑量組的抑瘤率分別為36.06%、23.84%，青蒿素聯(lián)合CTX藥物組的抑瘤率為61.49%，都具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明青蒿素具有抗Lewis肺癌的作用。在實驗中，免疫器官的臟器質(zhì)量是衡量機體免疫功能的初步指標，與模型對照組比較，雖然青蒿素對Lewis肺癌小鼠的胸腺質(zhì)量和脾臟質(zhì)量無顯著差異，但是小鼠的胸腺和脾臟質(zhì)量都有所增加。而陽性藥物CTX和聯(lián)合用藥組，Lewis肺癌小鼠的胸腺質(zhì)量和脾臟質(zhì)量顯著減少(P<0.01)，推測CTX可使小鼠的脾臟和胸腺受到抑制，對機體有一定的毒害作用。

近些年來研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，細胞因子TNF-α與IFN-γ發(fā)揮著不可忽視的作用。目前TNF-α、IFN-γ可作為腫瘤治療反應、治療機制和治療效果判斷的生物學指標[2]。TNF-α在腫瘤機體免疫功能中是非常重要的細胞因子，近年來被用于腫瘤細胞的凋亡及聯(lián)合化療藥物治療，被認為是與腫瘤惡化有關(guān)的細胞因子，與腫瘤惡病質(zhì)有關(guān)，同時又是一種免疫調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能作用[3,4]。TNF-α具有直接殺傷腫瘤細胞的作用，體現(xiàn)在某些磷脂酶、蛋白酶和核酸酶等，這些酶都是殺傷腫瘤細胞不可缺少的水解酶。而且，它還可以通過間接作用殺傷腫瘤細胞，例如阻斷腫瘤細胞血液供應，增加腫瘤血管內(nèi)皮細胞的凝血活性，使血管內(nèi)皮細胞受損，以及抑制血管內(nèi)皮細胞遷移等[5]。本實驗結(jié)果顯示青蒿素能促進TNF-α的產(chǎn)生，而且隨著劑量的增大，血清中TNF-α水平顯著提高。本實驗結(jié)果還顯示，青蒿素各組均能促進IFN-γ的產(chǎn)生，但以高劑量組最為顯著。IFN-γ與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有抗腫瘤細胞增殖作用，還有免疫調(diào)節(jié)作用，可介導T細胞對巨噬細胞的激活，并能直接增強巨噬細胞的殺傷能力；可誘導某些腫瘤細胞表達MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ類抗原，促進靜止的CD4+T細胞變化為Th1細胞，并抑制Th2細胞的增殖，促進CD8+CTL的成熟，增強CD8+CTL和NK細胞的殺傷活性[6,7]。通過抑制腫瘤細胞的增生，改變腫瘤細胞表面的性能及誘發(fā)新的抗原而被免疫監(jiān)視細胞識別并加以排斥，實現(xiàn)抗腫瘤效應和增強機體抗腫瘤能力。另外IFN-γ還可通過血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮其抑制腫瘤血管生長的作用[8]。且本實驗研究結(jié)果還顯示，青蒿素對小鼠Lewis肺癌具有顯著的抑制作用，表明青蒿素對動物肺癌的抑制與增強荷瘤小鼠細胞因子TNF-α、IFN-γ的免疫作用密切相關(guān)。

綜上所述，青蒿素不但能顯著抑制小鼠肺癌，而且能影響荷瘤小鼠外周血清TNF-α及IFN-γ細胞因子水平，從結(jié)果可以看出，隨著其劑量的增加，可使血清中TNF-α的水平明顯提高，而其還能顯著提高血清中IFN-γ的水平。這為臨床使用青蒿素抗癌機理從細胞因子水平上提供了一定的實驗依據(jù)。

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