★ 王萍 楊海燕 施旻

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330004)

在不能徹底治愈大多數(shù)惡性腫瘤的背景下，抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是防治腫瘤的關(guān)鍵因素。中醫(yī)藥在扶正祛邪的原則指導(dǎo)下，對(duì)改善腫瘤患者生存質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)[1]。目前中醫(yī)對(duì)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的病因病機(jī)認(rèn)識(shí)還不是很完善，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上提出了厥陰風(fēng)動(dòng)的病機(jī)是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，以此解釋惡性腫瘤的病因——“痰”、“瘀”“毒”等流竄至其他部位的過(guò)程。而烏梅丸作為厥陰病的主方，以烏梅為君藥，具有收斂肝風(fēng)的作用，全方兼有清熱燥濕解毒、益氣溫陽(yáng)等作用[2]。本研究以小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型為對(duì)象，觀察烏梅丸對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，探討厥陰風(fēng)動(dòng)病機(jī)在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c小鼠，20±2g，雌性，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2011-0003。

1.2 藥物與試劑 烏梅丸方(烏梅20g、細(xì)辛3g、干姜6g、桂枝6g、淡附片6g、蜀椒4g、黃連3g、黨參10g、當(dāng)歸10g、黃柏6g)各組成藥物采用配方顆粒劑，由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)。臨用前按說(shuō)明將顆粒劑倒入容器中，加開(kāi)水溶解，冷卻后備用，制成1g/mL生藥濃度藥液。

FAS antibody、FAS-L antibody、兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 細(xì)胞株 小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞株由江西中醫(yī)藥大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉波老師惠贈(zèng)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.4 方法

1.4.1 乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)與接種造模 乳腺癌4T1細(xì)胞經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后，收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，以無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整為1×107個(gè)/mL濃度細(xì)胞懸液。于BALB/c小鼠第4對(duì)乳腺右側(cè)乳墊下接種細(xì)胞液0.1mL。1周后觀察接種處腫瘤生長(zhǎng)情況，增殖為綠豆大小的腫瘤即造模成功。

1.4.2 動(dòng)物分組與用藥 選擇腫瘤大小一致的小鼠隨機(jī)分為4組，其中藥物組3組，模型對(duì)照組1組。藥物組分別為烏梅丸全方組(簡(jiǎn)稱(chēng)烏梅丸組)、烏梅丸去烏梅組(簡(jiǎn)稱(chēng)去烏梅組)及烏梅單味藥組(簡(jiǎn)稱(chēng)烏梅組)。根據(jù)小鼠體重，以人臨床用藥折算量進(jìn)行藥物干預(yù)1個(gè)月。

1.4.3 一般情況觀察 每天觀察各組小鼠的取食情況、精神狀態(tài)、毛發(fā)整齊與光澤度及死亡情況。

1.4.4 腫瘤生長(zhǎng)曲線 每隔4天用游標(biāo)卡尺測(cè)量乳腺癌接種處腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積，瘤體積=0.5×長(zhǎng)徑×短徑×短徑。取各組平均體積，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4.5 抑瘤率 藥物干預(yù)結(jié)束后稱(chēng)量小鼠體重，并剝離接種處腫瘤，稱(chēng)取瘤重。抑瘤率IR(%)=(1-藥物組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100%。

1.4.6 腫瘤轉(zhuǎn)移觀察 剝離接種處腫瘤后，肉眼探查其他部位可見(jiàn)腫瘤情況。暴露胸腔，完整分離肺臟后，置于Bouin's液中固定24h，無(wú)水乙醇脫色，觀察肺部轉(zhuǎn)移灶情況。

1.4.7 瘤組織Fas與FasL分子的表達(dá) 剝離后的腫瘤塊立即置于4%中性甲醛中固定24h，經(jīng)常規(guī)程序制作成石蠟組織切片。采用兩步法免疫組化方法觀察瘤組織Fas和FasL分子的表達(dá)情況，用圖像分析儀進(jìn)行圖像采集。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 19.0分析軟件，多組均數(shù)比較采用應(yīng)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)的LSD檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 荷瘤小鼠至20天左右，烏梅丸組各小鼠活動(dòng)狀態(tài)好，毛發(fā)整齊有光澤，其余三組活動(dòng)狀態(tài)欠佳，毛發(fā)亂而少光澤。至26天后去烏梅組、模型對(duì)照組各死亡1只，至28天烏梅組死亡1只。

2.2 腫瘤生長(zhǎng)曲線 各組乳腺癌接種原位瘤的體積如表1、圖1所示：腫瘤的增殖趨勢(shì)在各組間一致，隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積不斷的增長(zhǎng)；實(shí)驗(yàn)最后一次測(cè)量時(shí)間點(diǎn)表明，各藥物組的平均瘤體積較模型對(duì)照組小，但只有烏梅組與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.041)；藥物各組間腫瘤體積差異不明顯。

表1 乳腺癌接種原位瘤平均體積(mm3)

圖1 乳腺癌接種原位瘤生長(zhǎng)曲線

2.3 抑瘤率 各組的接種原位瘤經(jīng)剝離后稱(chēng)重，如表2所示：各藥物組的平均瘤重均比模型對(duì)照組輕，但只有烏梅組與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.019)；各藥物組間，烏梅組較去烏梅組瘤體積更小，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.048)。烏梅組、烏梅丸組、去烏梅組的抑瘤率呈下降趨勢(shì)。

表2 各組的瘤重及抑瘤率情況

2.4 腫瘤轉(zhuǎn)移情況 如表3結(jié)果所示：烏梅丸組除有1例出現(xiàn)胸腔積血外，其余胸腔部清晰，肺部無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)轉(zhuǎn)移瘤；去烏梅組有3例出現(xiàn)胸腔積血，肺部不清，有肉眼明顯可見(jiàn)轉(zhuǎn)移瘤，有1例出現(xiàn)腹部皮下綠豆大轉(zhuǎn)移瘤，1例出現(xiàn)頸部2處黃豆大轉(zhuǎn)移瘤灶；烏梅組有2例出現(xiàn)胸腔積血，肺部不清，有肉眼明顯可見(jiàn)轉(zhuǎn)移瘤，有1例出現(xiàn)右上肢腋下5mm×5mm腫瘤灶，1例出現(xiàn)膈肌轉(zhuǎn)移灶；模型對(duì)照組有3例出現(xiàn)胸腔積血，肺部不清，有肉眼明顯可見(jiàn)轉(zhuǎn)移瘤，1例出現(xiàn)肋間轉(zhuǎn)移灶。

Bouin's液固定肺部后，計(jì)算肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)，結(jié)果如表3和圖2，各藥物組的轉(zhuǎn)移灶數(shù)均較模型對(duì)照組少，其中烏梅丸組與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 各組乳腺癌轉(zhuǎn)移情況

1-烏梅丸組；2-去烏梅組；3-烏梅組；4-模型對(duì)照組

2.5 瘤組織Fas與FasL分子的表達(dá) 如圖3、圖4所示，乳腺癌細(xì)胞胞漿中的棕黃色顆粒即為Fas或FasL分子。烏梅丸組、去烏梅組和烏梅組的Fas表達(dá)均較模型對(duì)照組多；而FasL分子則是模型對(duì)照組表達(dá)更明顯。

A-烏梅丸組；B-去烏梅組；C-烏梅組；D-模型對(duì)照組

3 討論

烏梅丸是厥陰病的主方，主要用于蛔厥證，具有溫臟安蛔蟲(chóng)、寒熱并用、邪正兼顧的功效。后世醫(yī)家根據(jù)烏梅丸組方不斷擴(kuò)大其應(yīng)用范圍[3]，其中烏梅丸也應(yīng)用于惡性腫瘤相關(guān)病證的治療[4,5]。本研究依據(jù)厥陰風(fēng)動(dòng)病機(jī)可能與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)的假設(shè)，探討了烏梅丸對(duì)小鼠乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，并通過(guò)拆方研究同步探究了烏梅丸中酸斂熄風(fēng)的主藥烏梅的作用。研究結(jié)果表明，烏梅丸及各拆方組均可以一定程度抑制小鼠乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。

Fas與FasL是腫瘤細(xì)胞免疫中的重要分子。殺傷性淋巴細(xì)胞表達(dá)的FasL分子與腫瘤細(xì)胞表面的Fas分子結(jié)合，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。但惡性腫瘤發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞常改變自身的分子表達(dá)情況，從而逃避免疫細(xì)胞的識(shí)別殺傷，即腫瘤的免疫逃逸機(jī)制。其中惡性腫瘤細(xì)胞常調(diào)低自身Fas分子的表達(dá)而避免淋巴細(xì)胞的殺傷，另外也可以高表達(dá)FasL分子與高表達(dá)Fas分子的淋巴細(xì)胞結(jié)合導(dǎo)致后者的凋亡。這些免疫逃逸機(jī)制促使了惡性腫瘤細(xì)胞的存活，有利于其增殖轉(zhuǎn)移[6]。本研究結(jié)果也初步顯示了烏梅丸各組可以上調(diào)乳腺癌細(xì)胞Fas分子的表達(dá)，下調(diào)FasL分子的表達(dá)。這些機(jī)制可能與烏梅丸各組抑制乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

但拆方研究結(jié)果還沒(méi)有明顯的證據(jù)表明烏梅在全方抑制乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移中的作用。烏梅丸中包含有扶正的附子、黨參、當(dāng)歸等藥物，也包含祛邪的黃連、黃柏等藥物，全方的抑制腫瘤的作用是否與這些藥物相關(guān)還得進(jìn)行深入的探討。

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